Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Biomineralisatie kan intracellulaire, zoals in de vorming van magnetiet binnen magnetotactische bacteriën¹, of extracellulaire, zoals in de vorming van calciumcarbonaat in zee–egels spikes², van hydroxyapatiet die is gerelateerd met collageen in botten³ en glazuur die wordt geassocieerd met amelogenin in tanden⁴. Biomineralisatie is een complex proces dat afhangt van vele parameters in het levende organisme. Daarom is het, om het onderzochte systeem te vereenvoudigen, noodzakelijk om het effect van afzonderlijke componenten op het proces te evalueren. In veel gevallen wordt biomineralisatie geïnduceerd door de aanwezigheid van extracellulaire biopolymeren. Het doel van de hier gepresenteerde methode is als volgt: (1) het vormen van calciumcarbonaat kristallen in aanwezigheid van geïsoleerde biopolymeren in vitro, met behulp van een damp diffusie methode. (2) om het effect van de biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen.

In de aanwezigheid van organische additieven worden in vitro drie methoden gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat in de nabijheid van^5,6. De eerste methode, die wij als oplossingsmethode noemen, is gebaseerd op het mengen van een oplosbaar zout calcium (bv. CaCl₂) met een oplosbaar zout van carbonaat (bv. natriumcarbonaat). Het mengproces kan op verschillende manieren worden uitgevoerd: binnen een reactor met drie cellen die worden gescheiden door poreuze membranen⁷. Hier bevat elk van de buitenste cellen een oplosbaar zout en de centrale cel bevat een oplossing met het te testen toevoegingsmiddel. Calcium en carbonaat diffuus van de buitenste naar de middelste cel, resulterend in het neerslaan van het minder oplosbare calciumcarbonaat wanneer de concentraties van calcium en carbonaat hun oplosbaarheids product overschrijden, K_SP = [CA^{2 +}] [co₃ ^2-]. Een extra Meng methode is de double-Jet procedure⁸. Bij deze methode wordt elk oplosbaar zout van een afzonderlijke injectiespuit geïnjecteerd in een geroerd oplossing die het toevoegingsmiddel bevat, waarbij calciumcarbonaat neervalt. Hier, de injectie en dus de mengsnelheid is goed gecontroleerd, in tegenstelling tot de vorige methode waarbij menging wordt geregeld door diffusie.

De tweede methode die gebruikt wordt om CaCO₃ te kristalliseren is de Kitano methode⁹. Deze methode is gebaseerd op het carbonaat/waterstof carbonaat-evenwicht (2hco₃^– _(AQ) + CA^{2 +}_(AQ) CaCO_{3 (s)} + co_{2 (g)} + H₂O _(l)). Hier wordt CO₂ in een vaste vorm in een oplossing met CaCO₃ gebubbeld, waardoor het evenwicht naar links verschuift en het calciumcarbonaat daardoor oplost. Het onopgeloste calciumcarbonaat wordt gefilterd en de gewenste additieven worden toegevoegd aan de bicarbonaat-rijke oplossing. CO₂ mag dan verdampen, waardoor de reactie naar rechts verschuift en calciumcarbonaat ontstaat in aanwezigheid van de additieven.

De derde methode van kristallisatie van calciumcarbonaat, die we hier zullen beschrijven, is de damp diffusiemethode¹⁰. In deze opstelling wordt het organische toevoegingsmiddel, opgelost in een oplossing van calciumchloride, in een gesloten kamer in de buurt van ammoniumcarbonaat in een poedervorm geplaatst. Wanneer ammoniumcarbonaat poeder in kooldioxide en ammoniak ontbindt, worden ze diffuus in de oplossing die calciumionen bevat (bv. CaCl₂), en wordt calciumcarbonaat neergeprecipiteerd (Zie afbeelding 1 voor illustratie). De calciumcarbonaat kristallen kunnen groeien door langzame neerslag of door snelle neerslag. Voor de langzame neerslag wordt een oplossing die het toevoegingsmiddel in CaCl₂ -oplossing bevat, in een exsiccator naast het ammoniumcarbonaat-poeder geplaatst. Bij de snelle neerslag, beschreven in de lengte van het Protocol, worden zowel de additieve oplossing als het ammoniumcarbonaat dichter bij elkaar geplaatst in een multi-well plaat. De langzame neerslag methode zal minder nucleatie centra en grotere kristallen produceren, en de snelle neerslag zal resulteren in meer nucleatie centra en kleinere kristallen.

De hierboven beschreven methoden verschillen in hun technische complexiteit, in het niveau van controle en in de snelheid van het neerslag proces. De Meng methode vereist een speciale set-up⁶ voor zowel de dubbele straal als het driecellige systeem. In de Meng methode is de aanwezigheid van andere oplosbare contra-ionen (bijv. na⁺, cl^–)⁶ onvermijdelijk, terwijl in de Kitano-methode calcium en (BI) carbonaat de enige ionen in oplossing zijn en de aanwezigheid van extra tegen ionen (bijv. na⁺, cl^–). Bovendien, de Meng methode vereist relatief grote volumes en daarom is het niet geschikt voor het werken met dure biopolymeren. Het voordeel van de dubbele straal is dat het mogelijk is om de snelheid van de oplossing injectie te regelen en dat het een snel proces is in vergelijking met andere methoden.

Het voordeel van de Kitano-methode en de damp diffusiemethode is dat de vorming van calciumcarbonaat wordt geregeld door diffusie van CO₂ in/uit een CACL₂ -oplossing, waardoor tragere nucleatie-en neerslag processen kunnen worden sonde ^{11 , 12}. Bovendien kan de vorming van calciumcarbonaat door diffusie van co₂ lijken op calcificatie processen in vivo^13,14,15. In deze methode worden goed gedefinieerde en gescheiden kristallen gevormd¹⁶. Ten slotte kan het effect van enkelvoudige of meervoudige biopolymeren op de vorming van calciumcarbonaat worden getest. Dit maakt een systematische studie mogelijk van het effect van een reeks additieve concentraties op de vorming van calciumcarbonaat, evenals een studie van mengsels van biopolymeren-allemaal uitgevoerd op een gecontroleerde manier. Deze methode is geschikt voor gebruik met een groot aantal concentraties en volumes additieven. Het minimale gebruikte volume is ongeveer 50 μL en daarom is deze methode voordelig wanneer er een beperkte hoeveelheid beschikbare biopolymeren is. Het maximale volume is afhankelijk van de toegankelijkheid van een grotere goed plaat, of de exsiccator waarin de plaat of beker die CaCl₂ bevat, moet worden ingebracht. De hieronder beschreven methode is geoptimaliseerd voor het werken in een 96-put plaat met een biopolymeer gekozen als de proteïne TapA¹⁷.