미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구
Summary
우리는 Cryptosporidium parvum에 의하여 인간 장 및 기도 오르가노이드의 감염을 공부하기 위한 난모낭을 준비하고 포자조를 정화하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 장 내 오르가노이드 루멘으로 기생충의 미세 주입 과 오르가노이드의 면역 염색을위한 절차를 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 오르가노이드에서 생성 된 난모낭의 격리를 설명합니다.
Abstract
크립토스포리듐 파르블은 인간 설사 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 기생충의 병리학을 이해하고 효율적인 약물을 개발하기 위해서는 숙주의 상태를 재량화하는 체외 문화 시스템이 필요합니다. 그들의 기원의 조직과 밀접하게 닮은 오르가노이드는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 데 이상적입니다. 오르가노이드는 3차원(3D) 조직 유래 구조로, 성체 줄기세포에서 유래되고 유전적 수차 나 변형을 겪지 않고 장시간 배양에서 성장한다. 그들은 정점과 바소측 표면 모두극성을 잘 정의했다. Organoids는 약물 테스트, 바이오 뱅킹 및 질병 모델링 및 호스트 미생물 상호 작용 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 여기에서 우리는 인간 장 및 기도 오르가노이드를 감염시키기 위한 Cryptosporidium의 난모낭및 포자조를 준비하는 방법의 단계별 프로토콜을 제시합니다. 우리는 그 때 어떻게 microinjection가 오르가노이드 lumen로 미생물을 주입하기 위하여 이용될 수 있는지 설명합니다. 오가노이드가 호스트 미생물 상호 작용 연구에 사용될 수 있는 세 가지 주요 방법이 있습니다- 미세 주입, 기계 전단 및 도금, 그리고 단층을 만들어서. 미세 주사는 3D 구조의 유지 보수를 가능하게하고 기생충 볼륨의 정확한 제어 및 미생물에 대한 직접 정점 측면 접촉을 할 수 있습니다. 우리는 화상 진찰 또는 난모낭 생성을 위한 오르가노이드의 최적 성장을 위한 세부사항을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 새로 생성된 oocysts가 추가 하류 처리 및 분석을 위해 오르가노이드에서 격리될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
크립토스포리듐 감염의 치료 및 예방을 위한 약물 또는 백신의 개발은 인간1,2의생체내 상황을 정확하게 모방하는 체외 시스템의 부족에 의해 방해받고 있다. 현재 사용 가능한 시스템의 대부분은 단기 감염 (&5 일)을 허용하거나기생충3,4의전체 수명 주기를 지원하지 않습니다. 기생충의 완전한 발달을 가능하게 하는 그밖 시스템은 인간에 있는 생리적인 상황을 충실하게 되풀이하지 않는 불멸한 세포주 또는 암세포주에근거를 두어5,6,7 . 오르가노이드 또는 ‘미니 장기’는 다양한 조직 특정 성장 인자로 보충된 세포외 매트릭스에서 성장되는 3D 조직 유래 구조입니다. 오르가노이드는 다양한 장기와 조직에서 개발되었습니다. 그(것)들은 유전으로 안정되고 그들의 기원의 기관의 대부분의 기능을 되풀이하고, 시간의 연장된 기간 동안 문화에서 유지될 수 있습니다. 우리는 장 및 호흡기 크립토스포리디오증과 관련된 호스트 기생충 상호 작용의 연구를 위한 정확한 시험관 내 모델을 제공하는 Cryptosporidium으로 인간 장 및 폐 오르가노이드를 감염시키는 방법을 개발했습니다8 ,9,10,11,12,13. 다른 출판 된 문화 모델과는 달리, 오르가노이드 시스템은 실제 호스트 기생충 상호 작용을 대표하며, 기생충 수명 주기의 모든 단계를 연구 할 수 있도록 수명 주기를 완료 할 수 있으며 기생충 전파를 유지합니다. 최대 28 일10.
크립토스포리듐 방부는 호흡기와 장관의 상피를 감염시켜 장기간 설사 질환을 일으키는 양봉복합 기생충입니다. 내성 환경 단계는 오염된 음식과물(14)에서발견되는 난모낭이다. 일단 섭취되거나 흡입되면, 난모낭종은 상피 세포에 부착되는 4개의 포자형을 방출한다. 스포로조이스는 숙주 세포에 미끄러지고 숙주 세포 수용체를 교반하지만, 기생충은 세포를 완전히 침범하지 않으며, 숙주 세포가15를삼키도록 유도하는 것으로 보인다. 기생충, 세포 내 하지만 extracytoplasmic 구획 내에서 내면화, 세포의 꼭대기 표면에 남아, parasitophorous 백액 내에서 복제. 그것은 무성 생식의 두 라운드를 겪는다- 메로고니라는 과정. merogony 도중, 타입 I 메론은 새로운 세포를 침략하기 위하여 풀어 놓인 8개의 merozoites를 포함하는 개발합니다. 이 merozoites는 4개의 merozoites를 포함하는 타입 II 메론으로 발전하기 위하여 새로운 세포를 침략합니다. 이 merozoites, 풀어 놓일 때, 세포를 감염시키고 macrogamonts와 microgamonts로 발전합니다. 마이크로게임테스가 출시되어 난모낭으로 성숙하는 zygotes를 생산하는 매크로게임테스를 비옥하게 한다. 성숙한 난모낭은 이후에 내강으로 풀어 놓입니다. 난모세포는 후피를 재감염시키기 위해 즉시 방신하는 얇은 벽, 또는 다음숙주(14)를감염시키기 위해 환경으로 방출되는 두꺼운 벽중 하나이다. Cryptosporidium 수명 주기의 모든 단계는 이전에 우리의 그룹10에의해 개발 된 오르가노이드 배양 시스템에서 확인되었습니다.
인간 오르가노이드는 인간 조직을 충실하게 복제하기 때문에9,11,13, 및 Cryptosporidium10의모든 복제 단계를 지원하기 때문에 연구하기에 이상적인 조직 배양 시스템입니다. 크립토스포리듐 생물학 및 호스트 기생충 상호 작용. 여기에서 우리는 Cryptosporidium oocysts 및 황삭 한 포자화물 둘 다로 오르가노이드를 감염시키고, 이 조직 배양 시스템에서 생성된 새로운 oocysts를 격리하기 위한 절차를 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장 및 기도 오르가노이드에서 Cryptosporidium 기생충의 문화는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 정확한 모형을 제공합니다10 그러나 또한 많은 그밖 응용이 있습니다. 예를 들어, 유전자 변형 Cryptosporidium 기생충을 선택하고 전파하는 현재의 방법은 생체 내 감염에 필수적인 수정이있는 기생충의 격리를 허용하지 않는 마우스19의 통과가 필요합니?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 동물 및 비교 생물 의학 의학교, 농업 및 생명 과학 대학, 애리조나 대학, 투손, 애리조나, 미국, oocyst 생산 및 분석으로 우리를 도와 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 고립된 유기체 난소의 TEM 준비 그리고 화상 진찰을 위한 워싱턴 주립 대학에 프란체증 현미경 검사법 및 화상 진찰 센터 및 D.L. Mullendore 감사합니다.
D.D.는 네덜란드 과학 연구 기구(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)로부터 VENI 보조금을 받는 사람입니다. I.H.는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO-ALW, 863.14.002)의 VENI 보조금 수혜자이며 유럽 위원회 (제안 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)의 마리 퀴리 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 ERC 고급 보조금 협정 제 67013호에 따라 유럽 연구 위원회로부터 자금을 받았으며 R21 AT009174에서 RMO에 따라 NIH NIAIH로부터 자금을 받았습니다. 이 작품은 네덜란드 암 학회에 의해 부분적으로 자금을 조달하고 네덜란드 암 학회에서 보조금에 의해 지원된 Oncode 학회의 일부입니다.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
Referencias
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
