단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

원자력 현미경 검사법 (AFM), 다재 다능한 도구는세포 생물학 연구 1, 2,^3,4,5에서많은 응용 프로그램을 발견했습니다. 고해상도 이미징 기능 외에도, 네이티브 포스 프로빙 기능은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 단일 세포 수준^6,7에서현장에서 직접 조사 할 수 있게합니다. 이들은 세포내 세포 구조 또는 전체 세포 8,^9,10,11,12,특정 리간드/수용체 결합 강도의 강성을 포함합니다. 세포 표면(13)에대한 단일 분자 수준, 고체 입자와 세포의 단일 쌍 또는 두 세포 사이 또는 1,^2,14,15사이의 접착력. 후자의 두 가지는 종종 단세포 힘 분광법 (SCFS)^16으로분류됩니다. 다양한 스프링 상수와 쉽게 사용할 수있는 캔틸레버로 인해 AFM에 액세스 할 수있는 힘 범위는 몇 피코 뉴턴 (pN)에서 마이크로 뉴턴 (μN)까지 다소 광범위하며, 이는 수십 개의 힘을 포함하는 세포 이벤트의 전체 범위를 적절하게 커버합니다. pN의, 예컨대 수용체 계 단일 분자 결합, nN, 예컨대 식세포^{이벤트(15).} 이 큰 동적 힘 범위는 AFM을 광학/자기 핀셋 및 생체 막 힘 프로브와 같은 다른 힘 프로빙 기술에 비해 유리하게 만들며, 일반적으로 200 pN¹⁷ 미만의 힘으로 약한 힘 측정에 더 적합합니다. ^{, 18}. 또한, AFM은 spatiotempoy 정의 된 방식으로 단일 세포에 다양한 자극을 전달하는 고정밀 조작기로서 기능 할 수있다^4,19. 이는 실시간 단세포 활성화 연구에 바람직하다. 살아있는 세포 형광 화상 진찰과 결합된, 특정 자극에 대한 후속 세포 반응은 동시에 감시될 수 있습니다, 따라서 AFM 기지를 둔 SCFS는 세포 신호를 탐사하는 실용적인 공구를 제공하는 광학 화상 진찰로 대단히 견고하게 만듭니다. 예를 들면, AFM은 조골 세포^20에있는 칼슘 과도를 이끌어 내는 것을 요구되는 긴장을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 작품에서, 칼슘 과도는 AFM 팁으로 배양 된 조골 세포에 국한 된 힘을 적용 한 후 칼슘 비율 측정 이미징을 통해 형광으로 추적되었습니다. 최근, AFM은 간 성세포(HSC)가 성장한 콜라겐 섬유를 스트레칭하는 데 사용되었으며, 이러한 메카노-트랜스듀싱 HSC 활성화는 형광 Src 바이오센서에 의해 실시간 모니터링되었으며, 그 인산화는 바이오 센서의 형광 강도는 HSC 활성화^3과상관관계가 있습니다.

AFM 기반 SCFS 실험에서 AFM 캔틸레버의 적절한 기능화는 성공적인 측정을 향한 핵심 단계입니다. 우리의 연구 관심은 면역 세포 활성화에 초점을 맞추고 있기 때문에, 우리는 일상적으로 식세포증 및 / 또는 강한 면역 반응을 유발할 수있는단일 고체 입자와 같은 미립자 물질로 캔틸레버를 기능화4,^{14 , 15} 및 활성 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포로 면역 시냅스를형성할 수 있는 단일 T 세포 2. 단일 고체 입자는 일반적으로 공기 환경에서 에폭시 접착제를 통해 캔틸레버에 결합되는 반면, 단일 T 세포는 비 접착 성질로 인해 용액의 생체 적합성 접착제를 통해 캔틸레버로 기능화됩니다. 여기서는 이러한 두 가지 유형의 캔틸레버 수정을 수행하고 두 개의 관련 응용 프로그램을 제공하는 방법에 대해 설명합니다. 첫번째 응용은 세포 역학 관점에서 규정하는 T 세포의 억제 기계장치를 이해하기 위하여 AFM-SCFS를 가진 T 세포/DC 상호 작용을 탐구하는 것입니다. 두 번째는 수용체 독립적 인 포스 파티딜리노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2)의 분자 메커니즘을 밝히기 위해 실시간으로 고체 입자에 대한 대식세포의 세포 반응을 모니터링하기 위해 살아있는 세포 형광 이미징과 AFM을 결합하는 것을 포함합니다. 모에신은 식세포증을 매개했다. 이 프로토콜의 목적은 면역 학적 연구를위한 AFM 기반 단일 세포 분석을 통해 자신의 실험 설정을 설계하고 구현하기 위해 관심있는 연구자들이 참조 프레임 워크를 제공하는 것입니다.