Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.
Microalgen zijn de focus van onderzoek geweest op hun toepassingen bij de productie van hoogwaardige verbindingen, voedsel en brandstof. Bovendien zijn ze waardevolle fotosynthetische modellen die het inzicht in de elementaire cellulaire processen vergemakkelijken. Systeembrede studies maken uitgebreid en diepgaand inzicht in de moleculaire functies van de organismen mogelijk. Echter, meerdere onafhankelijke monsters en protocollen zijn vereist voor Proteomics, jachtgeweerlipidomics en metabolomica studies introduceren hogere fout en variabiliteit. Hier wordt een robuuste extractiemethode met hoge doorvoer voor de gelijktijdige extractie van chlorofyl, lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas gepresenteerd. De geïllustreerde experimentele opstelling is voor Chlamydomonas-culturen gesynchroniseerd met 12 h/12 h licht/donker voorwaarden. Monsters werden verzameld over een 24 h celcyclus om aan te tonen dat de metabolieten, lipiden en zetmeel gegevens verkregen met behulp van verschillende analytische platforms zijn goed conformed. Bovendien werden eiwit monsters die met hetzelfde extractie protocol werden verzameld gebruikt om gedetailleerde proteomica-analyses uit te voeren om hun kwaliteit en reproduceerbaarheid te evalueren. Op basis van de gegevens kan worden afgeleid dat de geïllustreerde methode een robuuste en reproduceerbare benadering biedt om het begrip van verschillende biochemische trajecten en hun functies met meer vertrouwen te vergroten voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek.
Microalgen zijn een rijke bron van natuurlijke producten (bijvoorbeeld brandstoffen, menselijke en dierlijke voeding, cosmetica en farmacologische stoffen). Talrijke onderzoeksinspanningen worden uitgevoerd om de efficiëntie van de productie van hoogwaardige producten van microalgen1,2,3,4te verbeteren. Op systemen niveau begrip van metabolisme is een voorwaarde om de kwaliteit en de opbrengst van natuurlijke producten5,6,7te verbeteren. Met de komst van functionele genomische technieken en verbeterde massaspectrometrie methoden, kunnen duizenden genen, transcripten, eiwitten en metabolieten tegelijkertijd worden bewaakt. Echter, meerdere monsters zijn vereist voor diepgaande Proteomics, jachtgeweerlipidomics en metabolomica studies, die vaak moeilijk te bereiken in eencellige organismen, vooral als de tijd cursus studies moeten worden uitgevoerd. Bovendien introduceert de verzameling en verwerking van verschillende monster aliquots in combinatie met verschillende protocollen voor het verzamelen van de zeer complexe omics-gegevens (d.w.z. Proteomic, lipidomic en metabolomics) variabiliteit, waardoor de integratie van gegevens een uitdagende taak.
Chlamydomonas biedt niet alleen een uitstekend microbieel Systeem voor het onderzoek van cellulaire processen, maar ook een handig model om de coördinatie van de celcyclus en het metabolisme te bestuderen. Dienovereenkomstig is een sterke coördinatie van de transcriptsuitdrukking met celcyclus aangetoond met behulp van een hoge resolutie transcriptome profilering van gesynchroniseerde cultuur van Chlamydomonas8. Over 80% van de geanalyseerde transcripten vertoonde een robuuste perioverplaats over een 24 uur celcyclus8. Evenzo bleken drooggewicht, eiwitten, chlorofyl, aminozuren en vetzuren van twee verschillende Chlamydomonas -stammen te correleren met celdeling in een studie waarbij elke 4 h9werd bemonsterd. Onlangs werd gemeld dat de metaboliet en lipide dynamiek van de cel verschuiving op basis van specifieke fasen van de cel cyclus10. De subtiele veranderingen in verschillende biomoleules waren mogelijk om te monitoren met behulp van een robuuste methyl tert-butyl ether (MTBE): methanol: watergebaseerde extractiemethode, die een ideaal uitgangspunt biedt voor uitgebreide multi-omics-analyse10 , 11.
De gepresenteerde protocol gidsen door middel van een reproduceerbare en efficiënte strategie10, voor de gelijktijdige extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster aliquot, voor de tijd verdwenen metabolomic en lipidomische studie van synchrone groei van Chlamydomonas-culturen. Naast het illustreren van de robuuste en reproduceerbare metabole en lipide-gegevens10, hier, de kwaliteit van de Proteomic monsters verkregen uit dezelfde pellet is ook aangetoond.
In dit artikel, we geïllustreerd een robuuste en zeer toepasselijk extractie protocol voor uitgebreide lipidomics, metabolomics, zetmeel en proteomica analyse uit een enkele pellet van 10-15 x 106 cellen. De methode is met succes geïmplementeerd in verschillende studies voor een breed scala van cellen en weefsels10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Hier presenteerden we een stapsgewijze pipeline voor multi-omics analyse van verschillende biomoleules uit een enkel monster geoogst uit Chlamydomonas Chlamydomonas (CC-1690 MT +) cultuur.
Het protocol biedt een robuuste en reproduceerbare benadering om meerdere monsters tegelijk te verwerken, voor de analyse van verschillende biomoleules. Echter, een aantal kritische stappen moeten worden verzorgd om de technische variatie te minimaliseren. Ten eerste moet het oogsten van de cellen zo snel mogelijk plaatsvinden, terwijl de uniforme voorwaarden voor alle geoogste monsters gehandhaafd blijven om de biologische toestand van de cellen te behouden. Hoewel we centrifugeren gebruikten om de cellen te oogsten, kunnen alternatieve oogst strategieën worden gebruikt voor het oogsten van de monsters. Echter, het is belangrijk op te merken dat verschillende oogst strategieën zijn gekend om invloed op de metabole toestand van de cellen37 vandaar, consistente oogst aanpak moet worden gebruikt voor alle experimentele monsters. Ten tweede is het belangrijk om te voorkomen dat de bovenste niet-polaire fase met chlorofyl wordt gedroogd, omdat dit de niveaus van opgeloste chlorofyl in het oplosmiddel dat de normalisatie factor voor de monsters beïnvloedt, kan beïnvloeden. Tot slot moet er voorzichtig worden opgetreden bij het verwijderen van de resterende polaire fase om de proteïne-en zetmeel korrel te verkrijgen, om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord die het zetmeel-en eiwitgehalte kan beïnvloeden.
Aldus gepresenteerd extractie protocol biedt verschillende voordelen voor Multiple-omics data-analyse. Naast het minimaliseren van het aantal benodigde monster aliquots, vermindert het ook de variatie tussen de analytische resultaten die voor verschillende biomoleules zijn verkregen. Dit maakt een directe vergelijking mogelijk van de resultaten verkregen uit de primaire metabolieten, lipiden en proteomische gegevens. Op dezelfde manier kan de gelijktijdige extractie van meerdere samengestelde klassen consistente en uniforme normalisatie strategie van de verschillende gegevenssets. Dit is met name van toepassing als normalisatie moeilijk te bereiken is met behulp van droog of vers gewicht38 of celnummer.
Het protocol kan worden uitgevoerd voor de routine screening van een complex biologisch monster. Deze holistische metabolomic, lipidomic en Proteomic datasets kunnen uitgebreide informatie bieden over systematische veranderingen in het metabolisme. Bovendien geeft de gegevens verkregen uit de proteomica-analyse inzicht in de kwantitatieve (overvloed) en kwalitatieve (modificaties) veranderingen in eiwitten ten opzichte van de metabolieten. Het integreren van omics-gegevens zou dus diepgaande informatie kunnen onthullen over veranderingen die worden veroorzaakt door genetische of biotische en/of abiotische verstoringen van een biologisch systeem. Dus, verhelderende moleculaire veranderingen van specifieke metabole trajecten of cellulaire processen. Op dezelfde manier kunnen deze gegevens met hoge doorvoer identificatie van doelen voor de metabole engineering en verfijnen of testen van voorspellingen van genoom schaal metabolische modellen37,39.
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn Gudrun Wolter en Änne Michaelis zeer erkentelijk voor de uitstekende technische assistentie. We willen alle leden van het Giavalisco Lab bedanken voor hun hulp. We zijn de Max Planck Society dankbaar voor de financiering van het onderzoek en FAPESP voor het Fellowship of L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |