카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화
Summary
여기에 제시된 것은 염료 희석을 이용한 항원 단백질 또는 펩티드에 반응하여 증식CD4+ T 세포를 측정하기 위한 프로토콜이다. 이러한 분석종은 희귀 항원 특이적 T 세포에 특히 민감하며 항원 특이적 세포의 복제를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.
Abstract
기재된 것은 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 측정하기 위한 간단한, 시험관내, 염료 희석-기반 방법이다. 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)와 같은 안정적이고 무독성형 형광 염료의 발달은 유세포분석으로 검출된 바와 같이 형광 염색의 감소에 의해 방관자로부터 구별되는 희귀한 항원 특이적 T 세포를 허용한다. 이 방법은 대체 접근법에 비해 다음과 같은 장점을 갖는다: (i) 저주파 T 세포에 매우 민감하며, (ii) 항원 또는 에피토프에 대한 지식이 필요하지 않으며, (iii) 반응 하는 세포의 표현형을 분석할 수 있고, (iv) 실행 가능하고 반응한다. 셀을 정렬하고 T 세포 복제와 같은 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
항원 특이적 T 세포를 검출하고 연구하는 능력은 세포 매개 면역의 연구에서 중요하다. 그러나, 이렇게 하는 것은 매우 약하고 검출하기 어려운 자기 항원 특정 CD4+ T 세포 반응을 위해 특히 도전적입니다. 항원 특이적 림프구 증식의 검출에 사용되는 일반적인 방법은 [3H]-티미딘이며, 이는 증식 세포의 DNA에 통합된 방사성 표지된 뉴클레오티드이다. [3H]-티미딘 분석법은 DNA 합성을 검출할 수 있지만, 이 방법은 DNA 합성이 유사분열과 독립적으로 개시될 수 있기 때문에 세포 분열을 간접적으로 측정한다(즉, 유전자 복제 및 세포자멸 1). 이 문제는 세포의 항원 특이적 증식이 상당한 세포 자멸 2를초래할 수 있다는 사실에 의해 복합되어 항원 특이적 증식의 잠재적 인 과대 평가로 이어진다. 더욱이, [3H]-티미딘 방법은 항원 펩티드로 자극된 PBMC에서 CD4+ 또는 CD8+ 계보 증식과 같은 림프구증증을 위한 자형질 정보를 제공하지 않는다.
2003년에는 CFSE 기반 증식 분석3,4라고불리는 CFSE를 이용한 최초의 염료 희석 분석법을 발표했다. CFSE는 세포내 리신 잔류물과 공유 결합을 형성하여 세포내 단백질에 안정적으로 결합하는 형광 염료입니다. CFSE 표지된 단백질은 딸 세포3사이에서 동등하게 분할되기 때문에, 분할된 세포는 또한 림프구 집단의 양적 자형질에 허용하는 유세포 측정에 의해 분할되지 않은 세포에서 구별될 수 있습니다. 실제로, CFSE 염색 의 시간에서 세포가 겪은 분열의 수는 어느정도 5까지 측정될 수 있습니다. 최근에는 셀트레이스 바이올렛 증식 염료(VPD) 및 CytoTrack 염료와 같은 유사한 염료가 많이 개발되어 유사한 방식으로 작용하고있습니다6. 이 프로토콜은 CFSE에 중점을 두지만 원칙은 다른 관련 염료에도 동일하게 적용됩니다.
펩타이드-MHC 테트라머 염색은 항원 특이적 CD8+ T 세포를 검출및 복제하는 데 널리 사용되는 방법이다. 이것은 잘 확립 된방법 7,8,9,10; 그러나, tetramer 기지를 둔 복제는 에피토프/MHC 제한의 기존 지식을 요구하고 각 에피토프는 새로운 에피토프 특이적 T 세포의 발견 그리고 복제의 범위를 제한하는 그것의 자신의 tetramer11를요구합니다. CFSE 기반 증식은 펩티드, 단백질 또는 세포 용해와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 간단하고 견고하며, 반응하는 CD4+ T 세포는 다운스트림 기능성 및 생화학적 특성 분석기12,13에사용하기 위해 정렬될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE-기반 증식은 항원 특이적 인간 CD4+ T 세포를 검출하고 열거하는 간단하고 강력한 방법이다. 이전에는 최적의 결과 4에 대해 CFSE의 최적농도를 사용하는 것이 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 너무 많은 CFSE는 증식을 폐지하는 반면, 너무 적게는 분할된 세포와 분할되지 않은 세포가 구별되는 것을 허용하지 않습니다. 대조적으로, CFSE의 상대적으로 높은 농도 (5.0 μM…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 의해 지원되었다: 청소년 당뇨병 연구 재단 [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). 국립 보건 의료 연구 위원회 (NHMRC GNT123586) (S.M.), 당뇨병 호주 연구 신탁 밀레니엄 상 (Y17M1-MANS) (S.M.), 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (S. M., A.D., E.T., M.S.), 및 NHMRC 대학원 장학금 APP1094337 및 JDRF 박사 학위 업 장학금 (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
Referencias
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
