Количественная оценка пролиферации антигена человека конкретных CD4и Т-клеток с использованием Carboxyfluorescein Succinimidyl Эфир
Summary
Представлен протокол для измерения размножающихся CD4и Т-клеток в ответ на антигенные белки или пептиды с использованием разбавления красителей. Этот ассси особенно чувствителен к редким антиген-специфическим Т-клеткам и может быть модифицирован для облегчения клонирования антиген-специфических клеток.
Abstract
Описанный является простой, in vitro, на основе разбавления красителей метод для измерения антиген-специфических CD4и Т-клеток пролиферации в периферических клеток крови человека (PBMCs). Развитие стабильных, нетоксических, флуоресцентных красителей, таких как carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) позволяет отличать редкие, антиген-специфические Т-клетки от прохожих путем увлажнения флуоресцентного окрашивания, как обнаруживается цитометрией. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с альтернативными подходами: i) он очень чувствителен к низкочастотным Т-клеткам, (ii) не требуется никаких знаний об антигене или эпитопе, (iii) фенотип ответных клеток может быть проанализирован, и (iv) жизнеспособный, отвечая клетки могут быть отсортированы и использованы для дальнейшего анализа, такие как клонирование Т-клеток.
Introduction
Способность обнаруживать и изучать антиген-специфические Т-клетки имеет важное значение в исследованиях клеточного иммунитета. Тем не менее, это особенно сложно для аутоантигена конкретных CD4и Т-клеток ответов, которые являются очень слабыми и трудно обнаружить. Распространенным методом, используемым для обнаружения пролиферации антигена специфического лимфоцита, является тимидин, который представляет собой радиомаркированный нуклеотид, включенный в ДНК размножающихся клеток. Несмотря на то, что анализ «3H» может обнаружить синтез ДНК, этот метод является косвенным мерилом деления клеток, потому что синтез ДНК может инициировать независимо от митоза (т.е. во время дублирования генов и апоптоза1). Этот вопрос усугубляется тем фактом, что антиген-специфическое пролиферацияклеток может привести к значительному апоптозу 2, что приводит к потенциальной переоценке антиген-специфического распространения. Кроме того, метод «3H» -тимидина не обеспечивает фенотипическую информацию для распространения лимфоцитов, таких как CD4или CD8– распространение линии в ПБМК, стимулируемых антигенными пептидами.
В 2003 году мы опубликовали первый рассеивание разбавления красителя с использованием CFSE, называется CFSE основе пролиферации асссы3,4. CFSE является флуоресцентным красителем, который связывается с внутриклеточными белками, образуя ковалентную связь с внутриклеточными остатками лизина. Так как белки с маркировкой CFSE делятся поровну между дочерными клетками3, клетки, которые разделились, можно отличить от неразделенных клеток по цитометрии потока, что также позволяет количественное фенотипирование популяций лимфоцитов. Действительно, количество делений клетки претерпела со времени CFSE-окрашивания может быть измерена в некоторой степени5. В последнее время, многие подобные красители, такие как CellTrace фиолетовый краситель пролиферации (VPD) и CytoTrack краситель были разработаны, которые работают аналогичным образом6. Этот протокол фокусируется на CFSE, но принципы в равной степени применимы к другим связанным красителей.
Тетрамер пептида-MHC является широко используемым методом для обнаружения и клонирования антигена конкретных CD8и Т-клеток. Это устоявшийсяметод 7,8,9,10; однако, тетрамер основе клонирования требует существующих знаний о эпитоп / MHC ограничения и каждый эпитоп требует своего собственного тетрамера11, который ограничивает область открытия и клонирования новых эпитопных конкретных Т-клеток. Пролиферация на основе CFSE может быть использована с пептидами, белками или клеточными лисатами. Описанный в настоящем году протокол является простым и надежным, а ответные CD4и Т-клетки могут быть отсортированы для использования в нижепотечений функциональных и биохимических характеристик анализов12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пролиферация на основе CFSE является простым и надежным методом для обнаружения и перечисления антиген-специфических человеческих CD4и Т-клеток. Ранее было продемонстрировано, что использование оптимальной концентрации CFSE имеет важное значение для оптимальных результатов<sup class="xr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана: Фонд исследований диабета для несовершеннолетних (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N) (S. M.). Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC GNT123586) (S. M.), Премия по исследованию диабета Австралии (Y17M1-MANS) (S. M.), Программа поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории (S. M., A. D., E. T., M. S.) и NHMRC Аспирантская стипендия APP1094337 и стипендия JDRF PhD Top-up (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
Referencias
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
