Sistemas de expressão livre de célula são ferramentas poderosas e custo-eficiente para a síntese de alta produtividade e rastreio de proteínas importantes. Aqui, descrevemos a preparação do sistema de expressão de proteínas sem célula usando Vibrio natriegens para a produção de proteína rápida usando DNA Plasmideo DNA linear e do mRNA.
A bactéria Marinha Vibrio natriegens tem atraído considerável atenção como um host microbial emergente para biotecnologia devido a sua taxa de crescimento rápido. Um protocolo geral é descrito para a preparação da V. natriegens extratos bruto célula utilizando equipamentos comuns de laboratório. Este protocolo alto rendimento tem sido especificamente otimizado para a acessibilidade dos utilizadores e custo reduzido. Síntese de proteína sem célula (CFPS) pode ser realizado em reações de lote em pequena escala 10 μL em qualquer formato 96 ou 384 poços e reproducibly produz concentrações de > 260 μg/mL super pasta GFP (sfGFP) 3 h. em geral, extrato de célula bruta preparação e CFPS pode ser alcançado em dias completos de 1−2 por um único usuário. Este protocolo pode ser facilmente integrado em gasodutos de síntese de proteína existentes para facilitar os avanços na bio-produção e aplicações da biologia sintética.
Síntese proteica celular-livre é um método versátil e econômico para a expressão de proteínas valiosas ou peptídeos1,2,3,4. Historicamente, síntese proteica celular-livre foi realizada utilizando sistemas de expressão de Escherichia coli ; no entanto, tem havido um aumento recente no uso de organismos alternativos, não-modelo com propriedades romance como chassi para celular-livre expressão5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismos com perfis metabólicos únicos são principais candidatos como alternativas para sistemas sem célula de e. coli . Por exemplo, a bactéria Marinha que Vibrio natriegens é o crescimento rápido de todos os organismos conhecidos com um observado tempo de menos de 10 min13de duplicação. Isto tem atraído V. natriegens considerável atenção como um host microbial emergente para pesquisa e biotecnologia14,15,16,17,18. Dado que a taxa de crescimento rápido de V. natriegens tem sido associada a altas taxas de síntese proteica e eficiência metabólica19,20,21, aproveitando sua maquinaria celular para celular-free síntese pode expandir significativamente o kit de ferramentas para a produção de proteína rápida e seleção da elevado-produção.
Recentemente, uma célula livre V. natriegens sistema de expressão tem sido demonstrado que é capaz de produzir super pasta GFP (sfGFP) em concentrações de > 260 μg/mL em 3 h com um promotor de T79. O objectivo geral de desenvolver esse método foi fornecer aos usuários com um sistema de expressão de proteínas altamente acessível, eficiente, Reproduzível e alto rendimento de célula livre que pode ser preparado utilizando equipamentos comuns de laboratório em um curto espaço de tempo. Este protocolo utiliza 1L culturas em frascos de agitar, lise celular por sonication pulso e reações em pequena escala em lote em um formato de 96 ou 384 poços para maximizar a paralelização e taxa de transferência de rastreio. Uma expressão de proteína longa e sustentado é possibilitada pela suplementação de ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como uma energia fonte8,22,23. Ao completar com sucesso este protocolo, um usuário terá a capacidade de expressar uma proteína desejada ou extrair o conjunto de proteínas em um formato livre de célula usando V. natriegens célula bruta.
A partir de um estoque de glicerol, V. natriegens extratos de células bruto são preparados a partir de células colhidas em uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 1.0. Uma cultura de 1L renderá cerca de 2−3 mL de extracto, que é suficiente para mais de 800 sem célula reações no extrato bruto de célula de 25%. As proteínas podem ser expressas usando o plasmídeo DNA, DNA linear ou do mRNA; no entanto, degradação de modelo de DNA linear por nucleases endógenas permanece uma grande desvantagem ao usar o tipo selvagem V. natriegens célula livre sistema9. A partir de culturas de V. natriegens , proteína utilizável para aplicações a jusante pode ser alcançada por um único usuário em dias completos de 1−2.
Este protocolo foi otimizado para o selvagem-tipo V. natriegens e meios de crescimento bacteriano compostos por LB suplementado com sais V2 (Tabela de materiais). Outras cepas de V. natriegens podem ser cultivadas da mesma forma para gerar extratos bruto célula para célula livre reações; no entanto, seu uso requer otimização adicional do presente protocolo. Além disso, este sistema de expressão de proteínas sem célula foi otimizado usando ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como fonte de regeneração de energia primária. Outras fontes de regeneração de energia podem ser utilizados; no entanto, a otimização dos reagentes e calibração provavelmente será necessária para obter alto rendimento proteína expressão10,11.
Especial atenção aos vários passos críticos neste protocolo irá garantir produtividade máxima extrato de alto rendimento sem célula de produção de proteína. Primeiro, extrato bruto celular deve ser preparado de V. natriegens célula culturas colhidas numa fase meados-exponencial de crescimento; rendimento de proteína é máximo quando as culturas alcançam uma OD600 = 1,0 ± 0,2. Enquanto a produção de proteína sem célula é possível a partir de células colhidas em uma variedade de densidades ópticas, anteriormente encontramos que as células colhidas em um estado exponencial de crescimento produzem significativamente mais proteína9. Os efeitos observados no desempenho do extrato bruto de célula de densidade óptica são consistentes com aquelas relatadas para outros sistemas de expressão livre de células derivados de células cultivadas em condições de cultura do lote1. Porque V. natriegens cresce a uma taxa rápida, é fundamental acompanhar de perto as densidades ópticas culturas. Em geral, espera-se que V. natriegens culturas reproducibly devem alcançar uma OD600 de 1.0 dentro 1−1.5 h usando este protocolo; no entanto, as condições de crescimento individual como o uso de confundiam versus não-perplexo frascos, que afeta a aeração, ou air contra incubação de água, que afeta a taxa e a estabilidade da temperatura de incubação, podem alterar o tempo de crescimento. Além disso, geralmente recomenda-se cultura de pelo menos 250 mL de V. natriegens num balão de 1L perplexo para garantir um pellet de células grandes na colheita de fácil manipulação e transferência. Isso melhora consideravelmente o sucesso da preparação do extrato bruto de celular, bem como aumenta o volume total do extrato produzido a partir de uma pelota. Ao usar a preparação de escala menor, as condições de cultura e reagentes podem ser ajustados adequadamente. Para a fermentação em larga escala, ainda mais otimização das condições de cultura pode ser necessária. Finalmente, para garantir o rendimento de alta proteína, é fundamental que a célula pelotas são processadas imediatamente após a colheita, ou no prazo de 1−2 dias de armazenamento a-80 ° C.
A Lise adequada do centrifugado pelo sonication pulso é crítico para o sucesso da expressão da proteína sem célula e muitas vezes é o aspecto mais difícil do presente protocolo para novos usuários. Normalmente, uma pelota bem lisada produzirá um volume significativo de extrato líquido livre de detritos. O extrato deve ser ligeiramente viscoso, mas pode facilmente ser pipetado quando alíquotas em armazenamento tubos antes de flash congelamento em nitrogênio líquido. Figura 3 mostra uma representação de um pellet bem lisado (Figura 3A) em comparação com uma pelota mal lisada (Figura 3B) após a etapa de centrifugação de lise de post. Uma indicação importante de lise celular completa é uma célula bruta extrair proteína total concentração > 20 mg / mL, conforme determinado por um ensaio de proteínas totais (etapa 2.13). Sonication excesso ou aquecimento excessivo do extrato bruto de célula irá danificar a maquinaria celular, que não pode ser determinada sem executar uma reação celular livre. Assim, é altamente benéfico testar a eficiência do extrato com uma reação de controle antes de dedicar um tempo significativo e esforço para aplicações de expressão de proteínas a jusante. Enquanto otimização adicional pode ser necessária para equipamentos diferentes sonication, as etapas de pulso sonication descritas foram altamente reprodutíveis em nossas mãos.
O uso do modelo de DNA linear derivado do PCR amplificação, síntese de enzima de restrição ou síntese comercial gene pode aumentar significativamente a capacidade para a produção de proteína de alta produtividade e rápido na célula livre expressão sistemas24. Enquanto a produção de proteína de modelo linear amplificada de PCR tem sido demonstrada, o rendimento destas reações são aproximadamente 13.5-fold inferior em comparação com reações utilizando plasmídeo modelo ADN às relações equimolar9. Isto é principalmente devido à instabilidade do modelo de DNA linear que é provável degradado por nucleases endógenas presentes no V. natriegens extrato bruto de célula. Enquanto do fago lambda que proteína GamS foi anteriormente usado para proteger o DNA Linear modelo de24,25, verificou-se ser incompatível com V. natriegens extrai9. Além disso, enquanto aumentando a concentração de modelo linear de DNA pode permitir um maior rendimento de proteína, sua rápida degradação no extrato bruto celular ainda será um grande problema.
Uma solução para superar a degradação de modelo de DNA linear pode ser suplementar sem célula reações com gerados a partir de in vitro a transcrição de DNA linear do mRNA. Por outro lado, o uso de um inibidor de RNase oferece proteção significativa contra a degradação de transcrição do mRNA e proteína apreciável rendimentos podem ser obtidos no formato sem célula reação 10 μL (Figura 5AB). Clonagem de DNA linear em um modelo circular através da ligadura TA, clonagem de TOPO, montagem de Golden Gate ou outros métodos de recombinação podem ser utilizados para contornar a degradação de modelo. No entanto, novas abordagens para a inibição da atividade da nuclease será necessárias eficiente na expressão de proteínas utilizando modelo linear de DNA.
Até à data, foram propostas várias abordagens diferentes para preparação do extrato bruto de proteína celular livre expressão9,10,11,26. No desenvolvimento deste protocolo, procuramos maximizar a acessibilidade dos utilizadores, reduzir o custo geral e minimizar etapas demoradas. Por exemplo, um rendimento de alta proteína é conseguido usando um processo de centrifugação-sonication duas etapas simples e não requer Homogeneizadores de célula, passos longos diálise ou reação de escoamento. É simples para executar em um curto período de tempo e não exige elevado nível de conhecimentos de laboratório. Assim, pode ajudar a facilitar a célula-livre expressão como um padrão para translação pesquisa acadêmica e projeto de processo industrial.
Este protocolo expande o toolkit, disponível para a investigação e a utilidade do V. natriegens, um organismo não-modelo com propriedades biológicas únicas. Maior rendimento de proteína pode ser conseguido empregando reações sem célula semi ou totalmente-contínua, para permitir a regeneração de energia, segundo de aminoácidos e a remoção de resíduos de produtos3,5,27. Além disso, a engenharia do selvagem-tipo V. natriegens para produzir tensões de DNAse – ou RNAse-deficiente, remoção de vias metabólicas deletérias e concorrentes e expressão de tRNAs adicional podem aumentar consideravelmente a produção de proteínas em Este sistema28,,29. Como podemos desvendar a biologia subjacente a seu rápido crescimento, desenvolvimento de sistemas V. natriegens célula sem acelerar bioproduction recursos e permitir a expressão robusta de peptídeos terapêuticos e pequenas moléculas sintéticas materiais.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de ciências médicas da General 1U01GM110714-01 e departamento de energia DE-FG02-02ER63445. Os autores gostaria de agradecer o Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam e Dr. Edgar Goluch para conselhos úteis sobre construir a seção de protocolo deste manuscrito.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |