İfade boş hücre sistemleri yüksek üretilen iş sentezi ve önemli protein testi ile taranması için maliyet-etkin ve güçlü araçlardır. Burada, Vibrio natriegens plazmid DNA, doğrusal DNA ve mRNA şablonunu kullanarak hızlı protein üretimi için kullanılan boş hücre proteini ifade sistemin hazırlanması açıklayın.
Vibrio natriegens deniz bakteri için biyoteknoloji, hızlı büyüme hızı nedeniyle ortaya çıkan bir mikrobiyal konağı olarak büyük ilgi topladı vardır. Genel bir protokol natriegens V. ham hücre özleri ortak labaratuar donanımları kullanarak hazırlanması için tanımlanır. Bu yüksek verimli iletişim kuralı özellikle oldu kullanıcı erişilebilirlik için en iyi duruma getirilmiş ve düşük maliyeti. Boş hücre protein sentezi (CFPS) küçük ölçekli 10 μL toplu tepkiler bir 96 – veya 384-iyi biçimde yapılabilir ve tekrarlanarak > 260 μg/mL süper klasör GFP (sfGFP) 3 h. içinde konsantrasyonları genel olarak verimleri, ham hücre ayıklamak hazırlık ve CFPS 1−2 tam gün içinde tek bir kullanıcı tarafından elde edilebilir. Bu iletişim kuralı gelişmeler biyo-üretim ve sentetik Biyoloji uygulamaları kolaylaştırmak için protein sentezi boru hatları mevcut kolayca bütünleştirilebilir.
Boş hücre protein sentezi değerli proteinler veya peptidler1,2,3,4bir ifade için çok yönlü ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Tarihsel olarak, boş hücre protein sentezi Escherichia coli ifade sistemleri kullanılarak yapılmıştır; Ancak, ortada bir son dalgalanma alternatif, Sigara model organizmalar yeni özelliklere sahip kasa ifade boş hücre5için,6,7,8,9 kullanarak , 10 , 11 , 12. benzersiz metabolik profilleri ile organizmalar E. coli boş hücre sistemleri alternatif olarak Başbakan adayları vardır. Örneğin, en hızlı büyüyen bir gözlenen ile tüm bilinen organizmaların Vibrio natriegens olduğunu deniz bakteri saat 10 dk13az iki katına. Bu araştırma ve biyoteknoloji14,15,16,17,18için gelişmekte olan bir mikrobiyal konağı olarak natriegens V. büyük ilgi topladı vardır. Natriegens hızlı büyüme oranına sahip verilen bu protein sentezi ve boş hücre için onun hücresel makine harnessing metabolik verimliliği19,20,21, yüksek oranda bağlantılı olmuştur sentez toolkit hızlı protein üretimi ve yüksek üretilen iş tarama için önemli ölçüde genişleyebilir.
Son zamanlarda, bir-boş hücre V. natriegens ifade sistem gösterdi süper klasör GFP (sfGFP) olarak T7 organizatörü93 h > 260 μg/mL konsantrasyonlarda üretme yeteneğine sahip olan. Bu yöntem geliştirme genel amacı ortak laboratuar ekipmanları zaman kısa bir miktarda kullanılarak hazırlanan son derece erişilebilir, maliyet-etkin, tekrarlanabilir ve yüksek verimli boş hücre proteini ifade sistem sunmak için yapıldı. Bu iletişim kuralını kullanan sallamak şişeler 1 L kültürlerde, hücre lizis darbe sonication ve küçük ölçekli toplu tepkileri parallelization ve filtreleme verimi en üst düzeye çıkarmak için bir 96 – veya 384-da biçiminde tarafından. Uzun, sürekli protein ifade tarafından 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) takviyesi bir enerji kaynağı8,22,23mümkün olmaktadır. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlayan, üzerine bir kullanıcı istenen bir protein hızlı yeteneğine sahip veya proteinlerin natriegens V. ham hücre kullanarak boş hücre biçiminde ayıklayabilirsiniz.
Gliserol stoktan başlayarak, V. natriegens ham hücre özleri 600 optik bir yoğunluk, hasat hücrelerden hazırlanır nm (OD600) 1.0. 1 L kültür yaklaşık 2−3 mL % 25 ham hücre özü itibariyle 800’den fazla boş hücre reaksiyonları için yeterlidir ekstresinin ortaya çıkarır. Proteinler plazmid DNA, doğrusal DNA veya mRNA şablonu kullanarak ifade edilebilir; Ancak, doğrusal DNA şablon bozulması endojen enzimler tarafından vahşi tip natriegens V. -boş hücre sistemi9kullanırken büyük bir dezavantaj kalır. Natriegens kültürler başlayarak, protein aşağı akım uygulamalarda kullanılabilir tek bir kullanıcı tarafından 1−2 tam gün içinde elde edilebilir.
Bu iletişim kuralı, vahşi tipli natriegens V. ve V2 tuzları (Malzemeler tablo) ile desteklenmiş LB oluşan Bakteriyel büyüme medya için en iyi duruma getirilmiş. Natriegens V. diğer suşların ham hücre özleri hücre-alerjik reaksiyonlar için oluşturmak için benzer şekilde kültürlü; Ancak, bunların kullanımı bu protokol ek optimizasyonu gerektirir. Ayrıca, bu boş hücre proteini ifade sistem 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) birincil enerji rejenerasyon kaynağı olarak kullanarak optimize edilmiştir. Diğer enerji yenilenme kaynakları kullanılabilir; Ancak, reaktifler ve Kalibrasyon duruma getirilmesi büyük olasılıkla yüksek verimli protein ifade10,11almak için gerekli olacaktır.
Bu iletişim kuralı birkaç kritik adım belirli dikkat maksimal özü verimlilik için yüksek verimli sağlayacak cep-Alerjik protein üretim. İlk olarak, ham hücre özü natriegens V. hücre kültürleri-üstel büyüme; aşamasında hasat üzerinden hazırlanan gerekir protein verimidir maksimal kültürler bir OD600 ulaştığınızda = 1.0 ± 0.2. Boş hücre protein üretim optik yoğunlukları bir mesafeden hasat hücrelerden mümkün olmakla birlikte, daha önce bir üstel büyüme durumda hasat hücreleri önemli ölçüde daha fazla protein9verim bulduk. Ham hücre özü performans gözlenen optik yoğunluk etkilerini formüllerdekilerle tutarlı toplu kültür koşulları1‘ yetiştirilen hücrelerden elde edilen diğer ifade boş hücre sistemleri bildirdi. Natriegens hızlı bir oranda yetişir çünkü kültürler optik yoğunluğunu yakından izlemek için önemlidir. Genel olarak, bu natriegens V. kültürler tekrarlanarak 1.0 bu iletişim kuralını kullanan 1−1.5 h içinde bir OD600 ulaştırılması gerekmektedir bekleniyor; Ancak, kullanımı gibi bireysel büyüme koşullarına karşı şişeler sigara şaşkın hangi etkiler havalandırma veya hava hızı ve istikrar, kuluçka sıcaklık etkiler, su kuluçka karşı büyüme zaman değiştirebilir, şaşkın. Ayrıca, genellikle büyük hücreli Pelet hasat kolayca idare ve transferi, emin olmak için natriegens bir 1 L şaşkın şişesi içinde en az 250 mL kültür için önerilir. Bu ham hücre özü hazırlık hem de özü hacmi bir Pelet üretilen artar başarısı büyük ölçüde artırır. Daha küçük ölçekli hazırlık kullanırken, kültür koşulları ve Kimyasalları uygun şekilde ayarlanabilir. Büyük ölçekli fermantasyon için daha fazla kültür koşulları duruma getirilmesi gerekli olabilir. Son olarak, yüksek protein verim sağlamak için bu hücre topakları hemen sonra hasat veya-80 ° C’de saklama 1−2 gün içinde işlenir önemlidir
Hücre Pelet darbe sonication tarafından uygun lizis boş hücre proteini ifade başarısı için çok önemlidir ve sık sık yeni kullanıcılar için bu protokolü en zor olanıdır. Genellikle, bir de lysed Pelet enkaz serbest olduğundan sıvı ekstresinin önemli bir cilt ortaya çıkarır. Özü biraz yapışkan olmalı ama ne zaman daha önce sıvı azot içinde buz gibi flaş depolama içine aliquoting Tüpler kolayca pipetted. Şekil 3 de lysed Pelet (şekil 3A) gösterimi sonrası lizis Santrifüjü adımdan sonra bir kötü lysed Pelet (şekil 3B) ile karşılaştırıldığında gösteriyor. Bir büyük tam hücre lizis ham hücre ayıklamak toplam protein konsantrasyonu > 20 mg / toplam protein tahlil (Adım 2.13) tarafından belirlenen mL göstergesidir. Aşırı sonication ya da aşırı ısınma ham hücre ekstresinin bir boş hücre tepki gerçekleştirmeden belirlenemiyor hücresel makine zarar verir. Böylece, özü verimlilik aşağı akım protein ifade uygulamaları için önemli ölçüde zaman ve çaba ithaf önce bir denetim tepki ile test etmek son derece faydalıdır. Ek optimizasyon farklı sonication ekipmanları için gerekli olsa da, darbe sonication merdiven tanımlamak son derece bizim ellerimizde tekrarlanabilir olmuştur.
PCR güçlendirme, restriksiyon enzimi Özet veya ticari gen sentez türetilmiş doğrusal DNA şablon kullanımı için boş hücre ifade sistemleri24yüksek üretilen iş ve hızlı protein üretim kapasitesi önemli ölçüde artırabilir. Protein üretim PCR güçlendirilmiş doğrusal şablondan göstermiştir, bu tepkiler verim iken yaklaşık 13.5-fold alt plazmid kullanarak tepkiler DNA şablon ekimolar oranları9ile karşılaştırıldığında. Bu öncelikle endojen nükleaz V. natriegens ham hücre hulâsa içinde mevcut tarafından bozulmuş olma ihtimali olan doğrusal DNA şablonu istikrarsızlık kaynaklanmaktadır. Protein GamS daha önce doğrusal DNA şablon24,25korumak için kullanılmıştır lambda fajının V. natriegens ile uyumlu olmadığı için9ayıklar bulundu. Ayrıca, doğrusal DNA şablonu konsantrasyonunu artırmak için daha yüksek bir protein verim izin iken, onun hızlı bozulma ham hücre özü hala büyük bir sorun olacak.
Doğrusal DNA şablon bozulması üstesinden gelmek için bir çözüm boş hücre reaksiyonları ile tüp bebek doğrusal DNA transkripsiyon oluşturulan mRNA şablonunu ek olarak olabilir. Öte yandan, bir RNase inhibitörü kullanımı mRNA transkript düşmesine karşı önemli koruma sağlar ve kayda değer protein verimleri 10 μL boş hücre tepki biçimi (5A rakamB) elde edilebilir. Döngüsel şablonda TA ligasyonu ile doğrusal DNA’sı klonlama, TOPO klonlama, Golden Gate derleme veya diğer rekombinasyon yöntemleri şablon bozulması aşmak için kullanılabilir. Yine de, daha fazla yaklaşımlar nükleaz aktivitesinin inhibisyonu için doğrusal DNA şablonu kullanarak verimli protein ifade için gerekli olacaktır.
Bugüne kadar birkaç farklı yaklaşım boş hücre proteini ifade9,10,11,26için ham özü hazırlanması için önerilmiştir. Bu iletişim kuralı geliştirirken, kullanıcı erişilebilirlik en üst düzeye çıkarmak, toplam maliyeti azaltmak ve zaman alıcı adımlar en aza indirmek için çalıştı. Örneğin, bir yüksek protein verim bir basit işlemdir sonication Santrifüjü kullanarak elde edilir ve hücre homogenizers, uzun diyaliz adımları veya axım tepki gerektirmez. Kısa bir süre içinde yürütmek basit ve yüksek düzey laboratuvar uzmanlık gerektirmez. Böylece, boş hücre ifade translasyonel akademik araştırma ve endüstriyel süreç tasarımı için bir standart olarak kolaylaştıracak yardımcı olabilir.
Bu iletişim kuralı alet elde edilebilir için soruşturma ve natriegens V., benzersiz biyolojik özelliklere sahip bir model olmayan organizma yarar genişletir. Yüksek protein verim elde enerji rejenerasyon için izin vermek için yarı – veya tamamen-sürekli boş hücre reaksiyonları istihdam ederek amino asitler ve atık ürünlerin3,5,27kaldırılması resupplying. Ayrıca, Dnaz veya RNAse eksik suşları üretmek için vahşi tipli natriegens V. mühendislik, zararlı ve rakip metabolik yollar kaldırılması ve ek tRNA ifade büyük proteinlerin üretimini geliştirmek Bu sistem28,29. Biz hızlı büyümesini temel Biyoloji çözmek gibi daha fazla natriegens V. boş hücre sistemlerinin geliştirilmesi bioproduction yetenekleri hızlandırmak ve tedavi peptidler, küçük moleküller ve sentetik sağlam ifade etkinleştirmek malzemeler.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 1U01GM110714-01 ve bölümü enerji DE-FG02-02ER63445 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam ve Dr. Edgar Goluch bu el yazması Protokolü bölümünde inşa üzerinde faydalı tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |