نظم التعبير خالية من الخلية أدوات قوية وفعالة من حيث التكلفة لتوليف الفائق وفحص البروتينات الهامة. وهنا يصف لنا إعداد نظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام ناتريجينس الضمة لإنتاج البروتين السريع باستخدام بلازميد الحمض النووي والحمض النووي الخطي قالب مرناً.
البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة قد حصل على اهتمام كبير كمضيف الميكروبية ناشئة عن التكنولوجيا الحيوية بسبب معدل النمو السريع. ويرد وصف بروتوكول عام للإعداد V. ناتريجينس مقتطفات خلية النفط الخام باستخدام معدات المختبرات المشتركة. لقد كان هذا البروتوكول ذات العوائد المرتفعة على وجه التحديد الأمثل للمستخدم إمكانية الوصول وتقليل التكلفة. تخليق البروتين الخلية الحرة (الحراجية) يمكن أن تنفذ في نطاق صغير 10 ميكروليتر دفعة ردود الفعل في شكل جيد 96 أو 384 وتكاثر غلات تركيزات > 260 ميكروغرام/مل سوبر المجلد التجارة والنقل (سفجفب) ضمن حاء 3 عموما، واستخراج النفط الخام خلية الحراجية وإعداد يمكن أن يتحقق في أيام كاملة 1−2 بمستخدم واحد. هذا البروتوكول يمكن دمجها بسهولة في الأنابيب توليف البروتين الموجودة لتسهيل التقدم في الإنتاج البيولوجي وتطبيقات البيولوجيا التركيبية.
تخليق البروتين الخلية الحرة طريقة فعالة من حيث التكلفة وتنوعاً للتعبير عن قيمة البروتينات أو الببتيدات1،2،،من34. تاريخيا، تم أداؤه تخليق البروتين خالية من الخلية باستخدام أنظمة تعبير الإشريكيّة القولونية ؛ ومع ذلك، كان هناك طفرة في الآونة الأخيرة في استخدام الكائنات الحية البديلة، غير نموذج مع خصائص الرواية كهيكل للتعبير خالية من الخلية5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-الكائنات مع التشكيلات الجانبية الأيضية فريدة من نوعها هي رئيس الوزراء المرشحين كبدائل لنظم كولاي خالية من الخلية. على سبيل المثال، تضاعف البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة هي الأسرع نمواً من جميع الكائنات المعروفة مع ملاحظتها وقت أقل من 10 دقيقة13. وهذا قد حصل V. ناتريجينس اهتماما كبيرا كمضيف الميكروبية المستجدة للبحوث والتكنولوجيا الأحيائية14،،من1516،،من1718. نظراً لأن معدل النمو السريع ف. ناتريجينس وقد ارتبطت بمعدلات عالية من البروتين وكفاءة الأيض19،20،21، تسخير جهازها الخلوي للخلية الحرة يمكن توسيع توليف مجموعة الأدوات لإنتاج البروتين السريع والفرز الفائق.
في الآونة الأخيرة، خلية حرة قد ثبت ف. ناتريجينس نظام التعبير التي هي قادرة على إنتاج مجلد سوبر التجارة والنقل (سفجفب) بتركيزات > 260 ميكروغرام/مل في ح 3 مع مروج T79. وكان الهدف العام لتطوير هذا الأسلوب لتزويد المستخدمين مع نظام تعبير الوصول للغاية، وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه، وعالية الغلة من بروتين خالية من الخلايا التي يمكن إعدادها باستخدام معدات مختبر مشترك في فترة قصيرة من الزمن. ويستخدم هذا البروتوكول الثقافات 1 لتر في قوارير اهتزاز، وتحلل الخلية بنبض سونيكاتيون، وردود الفعل دفعة صغيرة الحجم في شكل 96-384 جيدا أو الموازاة وفحص الإنتاجية إلى أقصى حد. تعبير بروتين طويلة ومستمرة بفضل مكملات حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كالطاقة مصدر8،،من2223. عند الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، وسوف يكون لمستخدم القدرة على التعبير عن بروتين المطلوب أو استخراج مجموعة من البروتينات في شكل الخلية الحرة باستخدام V. ناتريجينس خلية النفط الخام.
بدءاً من مخزون والغليسيرول، مستعدون V. ناتريجينس مقتطفات النفط الخام خلية من الخلايا حصاد بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) 1.0. سوف تسفر عن ثقافة 1 لتر تقريبا 2−3 مل من استخراج، وكافية لأكثر من 800 من ردود الفعل الخلية الحرة في استخراج النفط الخام من الخلية 25%. البروتينات يمكن التعبير عنها باستخدام بلازميد الحمض النووي، والحمض النووي الخطي، أو قالب مرناً؛ إلا أن تظل الخطية تدهور قالب الحمض النووي من نوكلياسيس الذاتية عيب كبير عند استخدام نظام النوع المتوحش ضد ناتريجينس الخلية الحرة9. بدءاً من الثقافات ف. ناتريجينس ، البروتين صالحة للاستخدام للتطبيقات المتلقين للمعلومات يمكن أن تحققه مستخدم واحد في 1−2 يوما كاملا.
وقد تم تحسين هذا البروتوكول البرية من نوع ف. ناتريجينس ووسائط النمو البكتيرية التي تتألف من رطل وتستكمل مع أملاح V2 (جدول المواد). يمكن استزراع سلالات أخرى من ف. ناتريجينس وبالمثل لتوليد مقتطفات خلية النفط الخام لتفاعلات الخلية الحرة؛ ومع ذلك، يتطلب استخدامها التحسين إضافية من هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين هذا النظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كمصدر للطاقة الأولية للتجديد. يمكن استخدام مصادر أخرى لتجديد الطاقة؛ ولكن الأمثل من الكواشف والمعايرة سيكون على الأرجح الحصول على تعبير البروتينات ذات العوائد العالية10،11.
إيلاء اهتمام خاص للعديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول سوف ضمان استخراج أقصى إنتاجية عالية الغلة الخلية خالية من إنتاج البروتين. أولاً، يجب أن يكون مستعدا استخراج النفط الخام خلية من الثقافات الخلية V. ناتريجينس تحصد في مرحلة منتصف المتسارع النمو؛ البروتين الغلة القصوى عندما الثقافات تصل OD600 = 1.0 ± 0.2. بينما من الممكن إنتاج بروتين الخلية خالية من الخلايا التي تحصد في طائفة من الكثافة البصرية، وجدنا سابقا أن تحصد في حالة أسي لنمو الخلايا تسفر عن أكثر بكثير البروتين9. لوحظت آثار الكثافة البصرية على أداء استخراج النفط الخام خلية تتسق مع تلك التي أبلغ عنها لنظم التعبير خالية من الخلايا الأخرى المستمدة من الخلايا التي نمت في ظروف ثقافة المجموعة1. لأنه ضد ناتريجينس ينمو بمعدل سريع، من المهم أن ترصد عن كثب الكثافة البصرية للثقافات. وبصفة عامة، يتوقع أن V. ناتريجينس الثقافات ينبغي أن يصل تكاثر التطوير التنظيمي600 1.0 داخل ح 1−1.5 استخدام هذا البروتوكول؛ ومع ذلك، حير ظروف نمو الفردية مثل الاستخدام مقابل قوارير غير حيرة، الذي يؤثر على التهوية، أو الهواء مقابل حضانة المياه، مما يؤثر على معدل واستقرار درجة حرارة الحضانة، قد يغير وقت النمو. وعلاوة على ذلك، من المستحسن عموما مالا يقل عن 250 مل من ف. ناتريجينس في قارورة حيرة ل 1 التأكد من بيليه خلية كبيرة في موسم الحصاد للتلاعب بسهولة ونقل الثقافة. وهذا يحسن إلى حد كبير نجاح إعداد استخراج النفط الخام من الخلية، فضلا عن زيادة الحجم الإجمالي لاستخراج تنتج من بيليه. عند استخدام إعداد مقياس أصغر، ظروف الثقافة والكاشفات يمكن تعديلها على النحو المناسب. للاختمار الواسعة النطاق، مواصلة تحسين ظروف الثقافة قد يكون مطلوباً. وأخيراً، لضمان محصول عالي البروتين، من الأهمية بمكان أن الكريات الخلية تتم معالجتها فورا بعد الحصاد، أو في غضون أيام 1−2 تخزين في-80 درجة مئوية.
تحلل السليم بيليه الخلية بنبض سونيكيشن أمر حاسم لنجاح التعبير بروتين الخلية الحرة وغالباً ما الجانب الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول للمستخدمين الجدد. عادة، سوف تسفر عن بيليه جيدا حجم كبير لاستخراج السائل خالية من الحطام. الاستخراج ينبغي أن يكون لزج قليلاً ولكن يمكن بيبيتيد بسهولة عندما اليقوتينج إلى مخزن أنابيب قبل فلاش التجميد في النيتروجين السائل. يصور الشكل 3 تمثيل بيليه جيدا (الشكل 3A) بالمقارنة بيليه سيئة (الشكل 3B) بعد الخطوة الطرد المركزي تحلل الوظيفة. مؤشرا رئيسيا لتحلل الخلية كاملة استخراج خلية النفط خام مجموع البروتين تركيز > 20 ملغ/مل كما يحددها مقايسة بروتين الكلي (الخطوة 2، 13). Sonication الإفراط أو التسخين المفرط لاستخراج النفط الخام خلية سيضر في جهاز الهاتف الخلوي، الذي لا يمكن تحديده دون القيام برد فعل الخلية الحرة. هكذا، فإنه مفيد للغاية لاختبار كفاءة استخراج بفعل تحكم قبل تكريس قدر كبير من الوقت والجهد لتطبيقات التعبير البروتين المتلقين للمعلومات. بينما التحسين إضافية قد تكون ضرورية للمعدات مختلفة سونيكاتيون، قد نبض sonication الخطوات الموضحة عالية استنساخه في أيدينا.
استخدام قالب الحمض النووي الخطي المستمدة من PCR التضخيم أو هضم إنزيم التقييد، أو التوليف الجيني التجارية يمكن أن تزيد القدرة على إنتاج البروتين الفائق والسريع في نظم التعبير الخلية الحرة24. بينما أظهر إنتاج البروتين من القالب الخطي تضخيم بكر، العائد من ردود الفعل هذه السفلي 13.5-fold تقريبا مقارنة بردود فعل استخدام بلازميد الدنا القالب في نسب اكويمولار9. وهذا يرجع أساسا إلى عدم استقرار قالب الحمض النووي الخطية التي من المحتمل قد أفسدتها nucleases الذاتية موجودة في V. ناتريجينس استخراج النفط الخام من الخلية. بينما بالعاثية أمداً التجمع البروتين قد استخدمت سابقا لحماية “الحمض النووي الخطي” قالب24،25، تم العثور على مقتطفات غير متوافقة مع V. ناتريجينس 9. بالإضافة إلى ذلك، بينما قد تسمح زيادة تركيز خطي الدنا القالب لعائد العالي بروتين، تدهور سريع في استخراج النفط الخام من الخلية ستظل مشكلة رئيسية.
قد يكون حلاً للتغلب على تدهور قالب الدنا الخطي لتكملة ردود فعل الخلية خالية مع قالب مرناً المتولدة من النسخ في المختبر للحمض النووي الخطي. من ناحية أخرى، استخدام المانع رناسي يوفر حماية كبيرة ضد تدهور نسخة مرناً ويمكن الحصول على غلة البروتين ملموس في شكل رد فعل الخلية الحرة 10 ميكروليتر (الشكل 5 أ، ب). استنساخ الحمض النووي الخطي في قالب تعميم عن طريق ربط تا، استنساخ توبو، الجمعية البوابة الذهبية أو غيرها من الأساليب جزئ قد تستخدم للتحايل على تدهور القالب. ومع ذلك، كذلك النهج لتثبيط النشاط nuclease سيكون ضروريا للتعبير البروتين كفاءة استخدام خطي الدنا القالب.
وحتى الآن، اقترحت عدة نهج مختلفة لإعداد استخراج النفط الخام للبروتين الخلية الحرة التعبير9،10،،من1126. في وضع هذا البروتوكول، سعينا إلى تحقيق أقصى قدر من الوصول إلى المستخدم وتقليل التكلفة الإجمالية وتقليل الخطوات تستغرق وقتاً طويلاً. على سبيل المثال، غلة نسبة عالية من بروتين يتم تحقيقه باستخدام عملية الطرد المركزي سونيكيشن من خطوتين بسيطة، ولا تتطلب أجهزة المجانسة الخلية، خطوات الغسيل الكلوي مطولة أو رد فعل الجريان السطحي. أنها بسيطة لتنفيذه في فترة قصيرة من الزمن ولا تتطلب مستوى عاليا من الخبرة المعملية. وهكذا، يمكن أن يساعد تيسير التعبير خالية من الخلايا كمعيار للبحث الأكاديمي متعدية الجنسيات وتصميم العملية الصناعية.
يوسع هذا البروتوكول مجموعة الأدوات المتاحة للتحقيق وفائدة ف. ناتريجينس، أحد الكائنات غير النموذجي مع الخصائص البيولوجية الفريدة. العالي البروتين العائد يمكن أن يتحقق باستخدام نصف أو كامل-مستمر الخلية الحرة ردود الفعل، للسماح لتجديد الطاقة، المتسللة من الأحماض الأمينية، والتخلص من نفايات المنتجات3،5،27. وعلاوة على ذلك، الهندسة من البرية من نوع ف. ناتريجينس لإنتاج سلالات الدناز أو رناسي ناقصة، إزالة الأيضية ضارة والمتنافسة، وتعبير عن ترنس إضافية يمكن أن يعزز إنتاج البروتينات في هذا النظام،من2829. كما كشف البيولوجيا الكامنة وراء نموها السريع، مواصلة تطوير V. ناتريجينس نظم خالية من الخلية قد تسريع قدرات بيوبرودوكشن وتمكين التعبير قوية من الببتيدات العلاجية، والجزيئات الصغيرة، والاصطناعية المواد.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة 1U01GM110714-01 وإدارة الطاقة دي-FG02-02ER63445. الكتاب يود أن يشكر الدكتور ريتشارد كوهمان، والدكتور جيني تام، والدكتور إدغار جولوتش لنصائح مفيدة في بناء قسم البروتوكول في هذه المخطوطة.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |