이 프로토콜은 생체 내에서 직접 다시 프로그래밍 된 인터뉴런을 생성하는 것을 목표로, 뇌의 AAV 기반 바이러스 시스템과 생체 내에서 세포 식별 및 추가 분석을 허용하는 FLEX 시냅신 구동 GFP 리포터를 사용하여.
생체 내에서 뇌의 상주 신경교를 기능및 아류형 특이적 뉴런으로 변환하는 것은 대체 세포 대체 요법의 개발을 향한 한 걸음을 내딛는 동시에 구내에서 세포 운명을 연구하는 도구를 만듭니다. 현재까지 생체 내 재프로그래밍을 통해 뉴런을 얻을 수 있었지만, 이러한 뉴런의 정확한 표현형이나 성숙 하는 방법은 자세히 분석되지 않았습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 AAV 기반 바이러스 벡터 시스템을 사용하여 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런의 보다 효율적인 변환 및 세포 별 식별을 설명합니다. 우리는 또한 재프로그래밍된 세포의 신경 성숙에 대한 기능적 평가를 위한 프로토콜을 제공한다. 플립-절제(FLEX) 벡터를 주입함으로써, 세포 리프로그래밍의 표적역할을 하는 뇌의 특정 세포 유형에 리프로그래밍 및 시냅신 구동 리포터 유전자를 함유한다. 이 기술은 새로 프로그래밍 된 뉴런의 쉬운 식별을 할 수 있습니다. 결과는 수득된 재프로그래밍된 뉴런이 시간이 지남에 따라 기능적으로 성숙하고, 시냅스 접촉을 받고, 다른 유형의 인터뉴런의 전기 생리학적 특성을 보여준다는 것을 보여준다. 전사 인자 Ascl1, Lmx1a 및 Nurr1을 사용하여, 재프로그래밍된 세포의 대다수는 빠른 스파이크, 파르브알부민 함유 인터뉴런의 특성을 갖는다.
이 방법의 전반적인 목표는 효율적으로 parvalbumin 발현 인터뉴런과 같은 기능및 아류형 특정 뉴런으로 생체 내 뇌 상주 glia를 변환하는 것입니다. 이것은 외인성 세포 공급원에 대한 필요 없이 뇌 질환에 대한 대체 세포 대체 요법의 개발을 향한 한 걸음을 제공합니다. 또한 세포 운명 스위치를 연구하는 도구를 만듭니다.
뇌는 새로운 뉴런을 생성하기위한 제한된 용량을 가지고. 따라서, 신경 질환에서, 뇌 수리를 위한 외인성 세포 소스의 필요성이 있다. 이를 위해, 세포의 상이한 공급원은 1차 조직, 줄기세포 유래 세포 및 재프로그래밍된 세포로부터의 세포를 포함하여 수년에 걸쳐 강렬한 연구를 거쳤으며 1,2,3. 뉴런으로 상주 하는 뇌 세포의 직접 리프로그래밍은 뇌 내부의 새로운 뉴런을 생성 하기 위한 환자의 자신의 세포를 사용 하 여 뇌 수리에 대 한 매력적인 방법을 제공할 수 있는 최근 접근. 현재까지, 몇몇 보고는 두뇌에 있는 바이러스성 벡터 납품을통해 생체 내 재프로그래밍에서 보여주었습니다 4, 5,6,78,9 와 같은 다른 두뇌 지구에서 피질, 척수, 줄무늬 및 중뇌 5,10,11뿐만아니라 손상되지 않은 병변 뇌 5,8,11,12. 억제 및 흥분성 뉴런 모두4,8,그러나 이들 세포의 정확한 표현형 또는 기능은 아직 상세히 분석되지 않았다.
이 프로토콜에서, 우리는 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런의 보다 효율적인 재프로그래밍 및 세포 별 식별을 설명합니다. 우리는 기능성 및 면역 조직 화학적 특성에 기초한 신경 성숙 및 표현형 특성의 기능 평가를 위한 프로토콜을 제공합니다.
우리는 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런을 확인하기 위해 Cre-유도성 AAV 벡터와 GFP 리포터를 사용했습니다. 이러한 바이러스 벡터의 선택은 레트로바이러스7,8의사용에 대한 대안으로서 뇌의 분할 및 비분할 세포 모두를 감염시키고, 표적 세포의 수를 증가시키는 장점이 있다. 뉴런 특이적 시냅신 구동 FLEX 리포터(GFP)를 통해 새로 생성된 뉴런을 구체적으로 검출할 수 있었습니다. 이전 연구는 생체 내 재프로그래밍7,9에 대한 아류형 특이적 프로모터를 사용했으며, 이는 또한 특정 세포 유형에서 유전자 및 리포터의 재프로그래밍을 허용한다. 그러나, 그 방법은 리포터 및 뉴런 마커의 공동 발현의 사후 분석에 의해 재프로그래밍된 뉴런의 추가 식별을 요구한다. 본 명세서에 기재된 것과 같은 뉴런 특이적 리포터의 사용은, 직접적인 식별을 허용한다. 이는 성공적인 변환에 대한 직접적인 증거를 제공하며 패치 클램프 전기 생리학에 필요한 라이브 세포 식별을 허용합니다.
생체 내 직접 재프로그래밍은 Cre-발현 마우스 균주에서 AAV FLEX 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 재프로그래밍 효능에 관해서는 마우스 균주 간의 차이가 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 줄무늬에서 생체 내 재프로그래밍의 경우, NG2-Cre 마우스 라인은 다른 균주와 비교할 때 더 효율적인 것으로 입증되었습니다. 새로운 동물 균주를 사용하기 전에, 동물의 나이가 종종이 단백질 발현의 특이성에 영향을 미치기 때문에 시간이 지남에 따라 Cre 발현에 관한 마우스 제공 자 지침을 확인하는 것이 중요합니다. 우리의 연구에서, 12주 이상 된 동물은 NG2 glia 이외의 세포에서 Cre 발현에 대한 위험이 있었기 때문에 생체 내 재프로그래밍에 사용되지 않았다. 시냅신-FLEX-GFP 시제만주입된 대조군 동물의 지속적인 존재 및 모니터링이 권장된다. 이것은 더 재프로그래밍 유전자 (ALN)가 사용되지 않는 경우에 나타나서는 안 되는 GFP 양성 세포를 위한 동물의 감시를 허용합니다.
새로 프로그래밍된 뉴런을 식별하기 위해 이 프로토콜에 설명된 뉴런과 같은 뉴런 특이적 식별 방법이 가장 중요합니다. 이는 동성애자 영역에서 재프로그래밍할 때 특히 관련성이 있는 내인성 주변 세포로부터 재프로그래밍된 뉴런을 적절히 식별하고 구별할 수 있게 한다.
그것은 또한 바이러스 성 주입에 대 한 올바른 구조를 대상으로 하는 것이 중요 하다. 따라서, 바이러스 성 주입을 위한 입체 외과는 중요하고 두뇌의 더 작은 구조물을 표적으로 할 때 특히 정확하게 접근할 필요가 있습니다.
우리는 이전에동일한 재프로그래밍 인자를 사용하여 생체 외 재프로그래밍 실험을 기반으로 생체 내 재프로그래밍의 결과를 예측하는 것이 신뢰할 수 없다는 것을 11을 보여주었습니다. 따라서 관심있는 모든 요소는 생체 내에서 테스트해야합니다. 우리의 손에, 많은 다른 요인 조합은 뉴런의 동일한 아류형을 제공 (즉, 생체 내에서 interneurons11) 이러한 유전자는 다른 뉴런의 개발에 연루 된 사실에도 불구하고.
재프로그래밍된 뉴런에 대한 전세포 패치 클램프는 섬세한 기술이며 조직 처리는 좋은 결과를 위해 중요하다. 얼음 차가운 Krebs 용액을 가진 관류는 조직 질을 향상시킵니다. 또한 패치 된 뉴런은 신중하게 치료해야합니다. 재프로그래밍된 뉴런의 성숙 및 표현형 정체성이 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 다소 평가될 수 있더라도, 이들 세포는 그들의 내인성 대조물과 완전히 비교할 수 없다. 게놈 시퀀싱(예를 들어, RNA 시퀀싱)과 같은 추가유형의 분석은 다시 프로그래밍된 세포 정체성을 추가로 확인하기 위해 사용되어야 한다.
본 명세서에 기재된 기술은 뇌에서 신경 대체가 필요한 미래 치료법의 개발을 위해 고려될 수 있다. 생체 내 재프로그래밍은 아직 초기 단계에 있으며 인간으로의 번역은 아직 예측되지 않았지만,이 기술은 뇌의 외인성 유전자 기능을 평가하고 생체 내에서 세포 성숙을 연구하는 방법을 제공 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
마르첼라 비르텔레는 마리 스크와도우스카-퀴리 혁신 교육 네트워크 및 보조금 협정 제676408호하에 유럽 연합 호라이즌 2020 프로그램(H2020-MSCA-ITN-2015)의 자금을 지원받았습니다. 다니엘라 릴란더 오토슨은 스웨덴 연구위원회 (2017-01234)의 지원을 받았습니다.
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
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pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
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CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
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Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
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Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
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Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
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4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
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streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
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OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |