Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Mancha ocidental é uma técnica que é comumente usada para detectar e quantificar a expressão da proteína, inclusive em tecido homogenates ou extratos. Ao longo dos anos, esta técnica tem levado a muitos avanços na pesquisa básica e clínica, onde ele pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para identificar a presença de doença^1,2. Mancha ocidental foi descrita primeiramente em 1979 como um método de transferência de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose e posteriormente Visualizar proteínas usando anticorpos secundários que foram radioactivamente rotulados ou conjugados com fluoresceína ou peroxidase³. Através do desenvolvimento de kits comercialmente disponíveis e equipamentos, métodos de mancha ocidentais foram cada vez mais padronizados e simplificados ao longo dos anos. Com efeito, a técnica agora é facilmente realizada por cientistas de diferentes origens e níveis de experiência. No entanto, tal como acontece com muitas técnicas experimentais semelhantes, o resultado das análises de Western blot é facilmente influenciado por escolhas feitas na concepção e execução do experimento. É importante, portanto, que a acessibilidade dos métodos padronizados de mancha ocidentais não obscurecer a necessidade de planejamento experimental e design. Considerações experimentais incluem, mas não limitada a, amostra de preparação e manipulação, seleção e validação de anticorpos para a deteção de proteína e eficiência de transferência de gel-para-membrana de particularmente pequenas ou grandes ( 140 kDa) proteínas^4,5,6,7,8,9. Qualidade de proteína da amostra original desempenha um papel significativo na determinação do resultado da análise subsequente borrão ocidental. Como a proteína pode ser extraída de uma grande variedade de fontes, incluindo linhas de células, os tecidos de modelos animais e tecidos humanos post-mortem e amostras de consistência na manipulação e processamento é necessário para obter resultados reprodutíveis. Por exemplo, quando é necessário o armazenamento a longo prazo das amostras para a extração da proteína, é importante perceber que, embora a proteína é geralmente estável a-80 ° C, as diferenças na estabilidade da proteína entre proteínas extraídas e tecidos intactos a-80 ° C têm sido relatado em¹⁰. Além disso, para obter estimativas reprodutíveis das quantidades de proteína, consistente homogeneização das amostras é crucial. Otimização de buffers de Lise diferentes e métodos de homogeneização (por exemplo, manual homogeneização em comparação com métodos automatizados) pode ser necessária antes de iniciar um experimento em grande escala quantitativo.

Estratégias de normalização para corrigir a variação de carga e quantificação de proteína são essenciais para obter resultados quantitativos, robustos da expressão da proteína. Limpeza de proteínas tais como β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) tem sido tradicionalmente usados para normalizar os níveis de proteína para quantificação. No entanto, normalização para proteínas de limpeza específico para fins de quantificação tem sido cada vez mais criticada sobre o passado poucos anos^11,12. Por exemplo, a expressão de proteínas de limpeza pode alterar entre diferentes estádios de desenvolvimento^13,14, através de tecidos do mesmo animal⁴e sob vários doença condições^{4,15 ,16,17}. Portanto, a utilização de proteínas específicas de limpeza limita as possibilidades de fazer comparações mais complexas entre a expressão da proteína de diferentes tecidos, em diferentes momentos e sob diferentes condições experimentais. Uma alternativa às proteínas de limpeza para controle para variação de carga de proteína é o uso de uma mancha de proteína total (TPS) que rotula e visualiza todas as proteínas presentes em uma amostra. TPS permite a normalização do sinal com base na carga de proteína total, ao invés de níveis de uma proteína específica e, portanto, a quantificação do sinal TPS devem ser comparáveis e reprodutíveis, independentemente da condição experimental, tipo de amostra ou Commit do desenvolvimento . Ponceau S, géis mancha-livre, R-350 de Coomassie, Ruby-Sypro, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (revisto em ref. 18) são exemplos de manchas de proteínas totais. Cada um desses métodos tem limitações e vantagens específicas e seleção do método depende do tempo e ferramentas disponíveis, bem como a instalação experimental^4,18.

Além de usar um TPS para corrigir a carga dentro da membrana e variabilidade de quantificação, pode ser necessário comparar amostras entre diferentes membranas, particularmente ao realizar a análise de expressão de proteínas em larga escala. No entanto, a variabilidade em fatores como eficiência e total intensidade de coloracao de proteína de ligação de anticorpos pode introduzir mais variabilidade entre amostras de proteínas que são analisadas em separado geles e membranas. Para quantificação robusta nesta situação, portanto, é necessário introduzir um novo passo de normalização para levar em conta a variabilidade between-membrana. Isto pode ser conseguido, incluindo um padrão de carregamento interno em cada uma das membranas que é mantida constante através de experiências analisadas separadamente. Esta norma pode assumir a forma de qualquer proteína lisada que podem ser obtidos em quantidades suficientes para ser usado em todas as membranas incluídas no experimento. Aqui, usamos um lisado de cérebro de rato (obtido de ratos do controle 5 dias de idade), como o cérebro é prontamente homogeneizado e a lisado de proteína obtida contém uma quantidade significativa de proteína em uma concentração elevada. Carregar um padrão interno em triplicado permite amostras em membranas diferentes para ser normalizado e comparado diretamente.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que desenvolvemos para permitir-nos realizar comparações complexas de variação de expressão de proteínas em tecidos diferentes, modelos de rato (incluindo modelos de doença) e momentos do desenvolvimento¹⁹. Combinando um fluorescente TPS com o uso de um padrão de carregamento interno, conseguimos superar as limitações existentes no número de amostras e condições experimentais que podem ser comparadas dentro de uma única experiência. Esta abordagem expande o uso de técnicas de borrão ocidental tradicional, permitindo assim que os investigadores para melhor explorar a expressão da proteína através de amostras e tecidos diferentes.