Summary

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Published: May 23, 2019
doi:

Summary

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Abstract

Afwijkende aggregatie van het eiwit tau is pathogeen betrokken bij een aantal neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD). Hoewel de Muismodellen van tauopathy hebben een waardevolle bron voor het onderzoek van de neurotoxiciteit mechanismen van geaggregeerde tau, is het steeds duidelijker dat, als gevolg van interspecies verschillen in fysiologie, de muis hersenen is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke conditie. Vooruitgang in de cel cultuur methoden hebben gemaakt menselijke neuronale culturen toegankelijk voor experimenteel gebruik in vitro en hebben geholpen bij de ontwikkeling van neurotherapeutics. Echter, ondanks de aanpassing van de menselijke neuronale cel culturen, in vitro modellen van de menselijke tauopathy zijn nog niet op grote schaal beschikbaar. Dit protocol beschrijft een cellulair model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen zijn transduced met lentiviral-afgeleide vectoren die code voor pathogene gemuteerde tau gesmolten tot een gele fluorescerende eiwit (YFP) verslaggever. Transduced culturen produceren tau aggregaten die positief vlek voor thioflavin en display markers van neurotoxiciteit, zoals verminderde axonale lengte en verhoogde lysosomale volume. Deze procedure kan een nuttig en kostenbesparend model zijn voor het bestuderen van menselijke therapeutische.

Introduction

Pathologische aggregatie van de microtubule-geassocieerde proteïne Tau is een bepalend kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD, Frontotemporale dementie (FTD), de ziekte van pick, en Progressieve supranucleaire parese (PSP)1. In een niet-zieke staat, tau bindt aan en stabiliseert microtubule filamenten in neuronale axonen2. Echter, ziekte-geassocieerde hyperphosphorylation van Tau bevordert tau aggregatie, dissociatie van microtubuli, en neuronale toxiciteit3. De toxische effecten van geaggregeerde tau kan leiden tot afwijkende activering van cholinerge4 en glutamaterge receptoren5 resulteert in de ontregeling van intracellulaire calcium en, uiteindelijk, celdood. In diermodellen, de vermindering van de hersenen tau verbetert de pathologie in AD muizen6 en in muismodellen van repetitieve mild traumatisch hersenletsel7.

Montage bewijs toont aan dat de structuur en bindende affiniteit van muis-afgeleide tau zijn verschillend van de mens afgeleide tau en dat de muis Tau is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke therapeutische8. Echter, menselijke cel tauopathy modellen zijn niet op grote schaal commercieel beschikbaar. Het algemene doel van dit werk is het beschrijven van een in vitro model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen worden transduced met lentiviral-afgeleide vectoren met Mutant menselijke tau constructen9. Tau aggregaat waardoor lentiviral constructen codeert voor de tau te herhalen domein harboring P301L en V337M mutaties gesmolten tot een YFP Reporter (tau-RDLM-YFP), terwijl de controle construeert code voor de wild-type (WT) tau herhalen domein gesmolten tot een YFP Reporter (tau-WT-YFP). Neuronale culturen transduced met behulp van deze methode Express ongeveer negen keer meer tau dan nontransduced culturen. Hoewel het bedrag van de tau-expressie overexpresse is ruwweg gelijk tussen tau-RDLM-YFP-en tau-WT-YFP-transduced cellen, alleen neuronen transduced met tau-RDLM-YFP display aggregaten. Culturen transduced met tau-RDLM-YFP vlek positief voor thioflavin en display reducties in axonale lengte en synaptische dichtheid. Daarom is dit cellulaire model kan een nuttig instrument voor het bestuderen van Tau aggregatie in vitro.

Protocol

1. bereiding van media en reagentia Ontdooi de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op 4 ° c (niet toestaan dat de kelder membraan matrix op te warmen of het zal stollen). Maak 1 mL hoeveelheid en bewaar ze bij-20 °C of-70 °C. Reconstrueren fundamentele fibroblastgroei factor (bFGF) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op 10 µ g/mL en maak 10 µ L-hoeveelheid. Bewaar ze bij 4 °C. Om een nieuwe, ongeopende, 500 mL fles DMEM/F12 met glutamine, voeg B27 (10 mL),…

Representative Results

Tau-RDLM-YFP-transduced neuronen werden fluorescerend gelabeld met YFP, en RDLM-transduced culturen weergegeven aggregaten na transductie. Deze inclusies gekleurd positief voor thioflavin (Figuur 1). Zoals Figuur 1 aantoont, produceert dit protocol neuronale culturen die thioflavin-positieve tau aggregaten weergeven. Voor de eerste experimenten, is het aanbevolen dat neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling de neuron-specifieke marker β-tubu…

Discussion

Dit protocol beschrijft de generatie van een in vitro model van de menselijke tauopathy dat vertoont zilver-vlek-positieve aggregaten en thioflavin-positieve neurofibrillaire klitten (NFTs). Bovendien, transduced cellen weer te geven tau-geïnduceerde pathologieën zoals morfologische gebreken, verminderde synaptogenese, en een verhoogd lysosomale volume. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een toegankelijke en kosteneffectieve model van neuronale tauopathy, die kan worden gebruikt voor drug screening …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen bedanken Dr. Peter Davies bij Albert Einstein College of Medicine voor het leveren van PHF-1 en CP13 antilichamen en Dr Marc Diamond aan de Universiteit van Texas, het zuidwesten, voor het verstrekken van de tau constructen. Dit werk werd gesteund door toelagen van de vereniging van Alzheimer (NIRG-14-322164) aan S.H.Y. en van het Instituut van Californië voor regeneratieve geneeskunde (TB1-01193) aan P.R.

Materials

10 cm culture dishes Thermofisher 12556002
15 ml tubes Biopioneer CNT-15
16% paraformaldehyde Thermofisher 50-980-487
24 well culture plates Thermofisher 930186
50ml tubes Biopioneer CNT-50
70% ethanol in spray bottle Various sources NA
B27 supplement Thermofisher 17504044
Basement membrane matrix (Matrigel) Corning 356231
Basic FGF Biopioneer HRP-0011
Bovine serum albumin Sigma A7906
Cell culture incubator Various sources NA
Centrifuge Various sources NA
DMEM-F12 culture media with glutamine Thermofisher 10565042
Ethanol (50% concentration or higher) Various sources NA
Flourescently labeled secondary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Fluorescent microscope Various sources NA
Glass coverslips Thermofisher 1254581
Glass slides Thermofisher 12-550-15
Human neural stem cells Various sources NA
Lentiviral vectors Various sources custom order
Mounting media Thermofisher P36934
N2 supplement Thermofisher 17502048
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140122
Phosphate buffered saline Thermofisher 14190250
Primary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Rocking or rotating platform Various sources NA
Sterile cell culture hood Various sources NA
Thioflavin S Sigma T1892-25G
Triton X-100 Thermofisher BP151-100
Water bath Various sources NA

Referencias

  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).

View Video