Summary

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Published: April 18, 2019
doi:

Summary

Мы предлагаем протокол, который показывает, как для дифференциации кератиноцитов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и фибробластов и создания 3D кожи органоид, используя эти кератиноцитов и фибробластов. Этот протокол содержит дополнительный шаг генерации модели гуманизированные мышей. Техника, представленная здесь будет улучшить дерматологические исследования.

Abstract

Кожа является крупнейшим органом органа и имеет множество функций. Кожа действует как физический барьер и защитник тела и регулирует функции организма. Биомиметики это имитация моделей, систем и элементов природы с целью решения сложных проблем человека1. Биомиметики кожи является полезным инструментом для исследований в пробирке болезней и в естественных условиях восстановительной медицины. Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеют характеристику неограниченного распространения и способность дифференциации три зародышевых. Человеческого iPSCs генерируются из различных начальных клеток, таких как клетки крови, кератиноциты, фибробласты и многое другое. Среди них мононуклеарных клеток пуповинной крови (CBMCs) появились как источник альтернативной ячейки с точки зрения аллогенной регенеративной медицины. CBMCs являются полезными в регенеративной медицине, потому что человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) ввод имеет важное значение для ячейки, банковской системы. Мы предоставляем метод дифференциации СВМС iPSCs в кератиноцитов и фибробластов и для поколения органоид 3D кожи. СВМС iPSC производные кератиноцитов и фибробласты имеют характеристики похож на главной ячейки строки. Organoids 3D кожи генерируются путем наложения эпидермального слоя на слой дермы. По пересадке этой 3D кожи органоид, формируется модель гуманизированные мышей. Это исследование показывает, что органоид 3D человеческого iPSC производные кожи может быть роман, альтернативные инструментом дерматологических исследований в vitro и in vivo.

Introduction

Кожа покрывает внешней поверхности тела и защищает внутренние органы. Кожа имеет различные функции, в том числе защиты от патогенов, поглощая и хранения воды, регулирование температуры тела и выделяют тела отходов2. Пересадке кожи могут быть классифицированы в зависимости от источника кожи; графтов, использование кожи от другого донора называются аллотрансплантантов, и трансплантатов, используя кожи пациента являются аутотрансплантантов. Хотя аутотрансплантатом является предпочтительным лечения из-за его низкой неприятие риска, биопсия кожи, трудно выполнить на пациентов с серьезными повреждениями или недостаточное количество клеток кожи. У больных с ожогами в три раза количество клеток кожи необходимы для покрытия больших территорий. В ситуациях, когда необходима трансплантация аллогенных приводит ограниченное количество клеток кожи от тела пациента. Аллотрансплантата используется временно, до аутологичной трансплантации может быть выполнена, поскольку обычно оно отклоняется иммунной системой хозяина, после примерно 1 неделю3. Чтобы преодолеть неприятие иммунной системой пациента, графтов должна исходить от источника с тем же идентификатором иммунитета пациента4.

Человеческого iPSCs являются источником новых клеток для клеточной терапии5. Человеческого iPSCs генерируются из соматических клеток, используя перепрограммирования факторов, таких как OCT4, SOX2, Klf4 и c-Myc6. С помощью человеческого iPSCs преодолевает этические и иммунологические аспекты эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)7,8. Человеческого iPSCs имеют плюрипотентности и могут дифференцироваться в три зародышевых9. Наличие HLA, решающим фактором в регенеративной медицине, определяет иммунный ответ и возможность отказа10. Использование пациента производные iPSCs решает проблемы отказа ограничения и иммунной системы клетки источник. CBMCs также стали источником альтернативной ячейки для регенеративной медицины11. Обязательное HLA набрав, которая происходит во время СВМС банковской, легко может использоваться для исследования и трансплантации. Кроме того, гомозиготных HLA-типа iPSCs может широко применяют для различных пациентов12. СВМС iPSC банк — Роман и эффективную стратегию для клеточной терапии и аллогенных регенеративной медицины12,,1314. В этом исследовании мы используем СВМС iPSCs, дифференцированные в кератиноцитов и фибробластов и генерировать слои стратифицированной 3D кожи. Результаты этого исследования свидетельствуют о СВМС iPSC производные 3D кожи органоид Роман инструмент для в vitro и in vivo дерматологические исследования.

Protocol

Все процедуры с участием животных были выполнены в соответствии с Закон о социальном обеспечении лабораторных животных, руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и руководящие принципы и политику для грызунов экспериментов институциональный уход животных и Исполь?…

Representative Results

Кожа состоит, по большей части, из эпидермиса и дермы. Кератиноциты тип основных клеток эпидермиса, и фибробласты тип основной ячейки дермы. Схема дифференциации кератиноцитов показана на рисунке 1A. СВМС iPCSc были сохранены в блюдо vitronectin покрытием (ри…

Discussion

Как новая альтернатива для персональной восстановительной медицины17было предложено человека iPSCs. Пациент производные персонализированные iPSCs отражают пациента характеристики, которые могут использоваться для моделирования заболевания, наркотиков скрининг и аутологич?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грант от Кореи здравоохранения технологии R & D проекта, Министерство здравоохранения, благосостояния и делам семьи, Республика Корея (H16C2177, H18C1178).

Materials

Adenine Sigma A2786 Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium) STEMCELL 05893 EB formation
Anti-Fibronectin antibody abcam ab23750 Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody abcam ab7800 Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody abcam ab85679 Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody abcam ab124762 Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody Santa cruz sc-7558 Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC Johnson & Johnson Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel) BD 354277 Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture AILEEE SK617 Skin graft
CaCl2 Sigma C5670 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I BD 354236 3D skin organoid
Collagen type IV Santa-cruz sc-29010 Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium Gibco 10744-019 Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose Gibco 11995065 Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium Gibco 11330-032 Component of differentiation medium
Essential 8 medium Gibco A1517001 iPSC medium
FBS, Qualified Corning 35-015-CV Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement  Gibco 35050061 Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin Invtrogen 12585-014 Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor Professional PC-02.10 Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium Gibco 17005-042 Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960 Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid Gibco 1140050 Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm HIROSE HC 2265-1 Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J The Jackson Laboratory 001303 Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm Hyundai Micro H10090 Plastic ware
Recombinant Human BMP-4 R&D 314-BP Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein R&D 236-EG Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid Sigma R2625 Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx TPP 93100 Plastic ware
Transferrin Sigma T3705 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts  Corning CLS3492 Plastic ware for 3D skin organoid 
Vitronectin Life technologies A14700 iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride peprotech 1293823 iPSC culture

Referencias

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).

View Video