Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte
Summary
Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.
Abstract
La pelle è il più grande organo del corpo e ha molte funzioni. La pelle agisce come una barriera fisica e protettore del corpo e regola le funzioni corporee. Biomimetica è l’imitazione dei modelli, sistemi e gli elementi della natura allo scopo di risolvere complessi problemi umani1. Pelle biomimetica è uno strumento utile per la ricerca di malattia in vitro e in vivo della medicina rigenerativa. Cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) hanno la caratteristica di proliferazione illimitata e la capacità di differenziazione di tre strati di germe. IPSCs umane vengono generati da varie cellule primarie, quali le cellule del sangue, cheratinociti e fibroblasti. Fra loro, cellule mononucleari del sangue ombelicale (CBMC) sono emersi come una fonte alternativa cellulare dal punto di vista della medicina rigenerativa allogenica. CBMC sono utili nella medicina rigenerativa perché umano del leucocita (HLA) l’antigene digitando è essenziale alla cella sistema bancario. Mettiamo a disposizione un metodo per la differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibroblasti e per la generazione di un 3D pelle organoid. Fibroblasti e cheratinociti CBMC-iPSC-derivati hanno caratteristiche simili ad una linea cellulare primaria. Il organoids pelle 3D vengono generati mediante la sovrapposizione di uno strato epidermico su uno strato dermico. Trapiantando questo organoid pelle 3D, viene generato un modello di topi umanizzati. Questo studio indica che un organoid 3D pelle umana iPSC-derivato può essere uno strumento di romanzo, alternativo per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.
Introduction
Pelle copre la superficie più esterna del corpo e protegge gli organi interni. La pelle ha diverse funzioni, tra cui la protezione contro gli agenti patogeni, assorbire e immagazzinare l’acqua, regolazione della temperatura corporea ed espellendo corpo rifiuti2. Gli innesti di pelle possono essere classificati a seconda dell’origine della pelle; gli innesti usando la pelle da un altro donatore sono denominati allotrapianti, e gli innesti usando la pelle del paziente sono gli autoinnesti. Anche se un autoinnesto è il trattamento preferito a causa del suo rischio basso rifiuto, le biopsie della pelle sono difficili da eseguire su pazienti con lesioni gravi o di un numero insufficiente di cellule della pelle. In pazienti con gravi ustioni, tre volte il numero delle cellule della pelle è necessario per coprire vaste aree. La disponibilità limitata delle cellule della pelle dal corpo di un paziente si traduce in situazioni dove è necessario il trapianto di allogenous. Un documento non autografo è temporaneamente utilizzato fino a trapianto autologo può essere eseguito poiché è rifiutata solitamente dal sistema immunitario dell’ospite dopo circa 1 settimana3. Per superare il rifiuto dal sistema immunitario del paziente, gli innesti devono provenire da una fonte con la stessa identità immune del paziente4.
IPSCs umane sono un emergenti fonte di cellule staminali terapia5. IPSCs umane vengono generati dalle cellule somatiche, utilizzando fattori di riprogrammazione come OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Utilizzando iPSCs umane supera le questioni etiche e immunologiche delle cellule staminali embrionali (ESCs)7,8. IPSCs umane hanno pluripotenza e possono differenziarsi in tre strati germinativi9. La presenza di HLA, un fattore critico nella medicina rigenerativa, determina la risposta immunitaria e la possibilità di rifiuto10. L’uso di derivati paziente iPSCs risolve i problemi di rigetto di limitazione e sistema immunitario cellulare-fonte. CBMC sono emerse anche come fonte alternativa cellulare per la medicina rigenerativa11. Obbligatorio HLA tipizzazione, che si verifica durante operazioni bancarie CBMC, facilmente utilizzabile per la ricerca e trapianto. Più ulteriormente, omozigoti iPSCs HLA-tipo può ampiamente applichi a vari pazienti12. Una banca CBMC-iPSC è un romanzo e una strategia efficace per la terapia cellulare e trapianto allogenico medicina rigenerativa12,13,14. In questo studio, usiamo CBMC-iPSCs, differenziate in cheratinociti e fibroblasti e generare strati della pelle 3D stratificato. Risultati da questo studio indicano che un organoid CBMC-iPSC-derivati della pelle di 3D è un nuovo strumento per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
IPSCs umane sono stati suggeriti come una nuova alternativa per la medicina rigenerativa personalizzata17. Paziente-derivato personalizzato iPSCs riflettono le caratteristiche dei pazienti che possono essere utilizzate per la modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e di trapianto autologo18,19. L’uso di derivati paziente iPSCs può anche superare problemi per quanto riguarda le cellule primarie, una mancanza di numeri di cel…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da una sovvenzione la Corea Healthcare Technology R & D Project, Ministero della sanità, Welfare e famiglia, Repubblica di Corea (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
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