Medições automatizadas do sono e da atividade locomotora em Cavefish mexicano
Summary
Este protocolo detalha a metodologia para quantificar o comportamento locomotor e sono na mexicana cavefish. Análises anteriores são ampliadas para medir esses comportamentos socialmente alojados em peixes. Este sistema pode ser amplamente aplicado para estudar o sono e a atividade em outras espécies de peixes.
Abstract
Em filos, sono é caracterizado por altamente conservadas características comportamentais que incluem o limiar de excitação elevado, rebote após privação de sono e consolidaram a períodos de imobilidade comportamental. O mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), é um modelo para estudar a evolução do traço em resposta à perturbação ambiental. A. mexicanus existir como formas de superfície-moradia olhos e várias populações de cavernas cegas que apresentam diferenças morfológicas e comportamentais robustas. Perda de sono tem ocorrido em várias populações cavefish evoluiu de modo independente. Este protocolo descreve uma metodologia para quantificação de sono e atividade locomotora na . mexicanus caverna e peixe de superfície. Um sistema de monitoramento de vídeo econômico permite comportamental de imagem de peixe de larvas ou adultos alojados individualmente por períodos de uma semana ou mais. O sistema pode ser aplicado a pescar envelhecido 4 dias pós fertilização através da vida adulta. A abordagem também pode ser adaptada para medir os efeitos de interações sociais no sono, gravando vários peixes em um único arena. Na sequência de gravações comportamentais, dados são analisados usando automated software de rastreamento e análise do sono é processada usando scripts personalizados que quantificam múltiplas variáveis de sono, incluindo duração, comprimento de tal e tal número. Este sistema pode ser aplicado a medida de sono, comportamento circadiano e atividade locomotora em quase qualquer espécie de peixe, incluindo zebrafish e famílias.
Introduction
Sono é altamente conservado em todo o reino animal nos níveis fisiológicos, funcionais e comportamentais1,2,3. Enquanto o sono em animais de laboratório mamíferos normalmente é avaliado por meio de eletroencefalogramas um e outro, gravações eletrofisiológicas são menos práticas em sistemas de pequeno modelo geneticamente favoráveis e assim o sono normalmente é medido com base no comportamento3 , 4. características comportamentais associadas com o sono são altamente conservadas em todo o reino animal e incluem o limiar de excitação aumentada, reversibilidade com estimulação e prolongada quiescência comportamental5. Estas medidas podem ser usadas para caracterizar o sono nos animais que vão desde o verme nematoide, c. elegans, através de de seres humanos6.
O uso de quiescência comportamental para caracterizar o sono requer software de rastreamento automatizado. Com software de rastreamento, períodos de actividade e imobilidade são detectados durante um número de dias, e longos períodos de inatividade são classificados como dormir7,8. Nos últimos anos, foram desenvolvidos vários sistemas de rastreamento para a aquisição de dados de atividade entre uma diversidade de sistemas de pequeno modelo geneticamente favorável; incluindo os vermes, moscas de fruta e peixe9,10,11. Estes programas são acompanhados por um software que permite o rastreamento automatizado do comportamento animal, incluindo ambos freeware de código aberto e software comercialmente disponível7,12,13,14 . Esses sistemas diferem em sua flexibilidade e permitem eficiente triagem e caracterização de fenótipos de sono em numerosos modelos geneticamente alteráveis.
Investigação genética de sono no peixe-zebra, Danio rerio, levou à identificação de vários genes e circuitos neurais que regulam o sono15,16. Enquanto isso forneceu um poderoso sistema para investigar a base neural do sono em um animal de laboratório de vertebrados, é muito menos conhecida sobre como sono evolui e como natural variação contribui para dormir o regulamento. O mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), evoluíram dramáticas diferenças no sono, atividade locomotora e ritmos circadianos17,18. Estes peixes existem como olhos superfície peixes que habitam os rios do México e sul do Texas e pelo menos 29 da caverna das populações em torno da região de Sierra Del Abra de México nordeste19,20,21. Notavelmente, muitas diferenças comportamentais, incluindo a perda de sono, parecem ter surgido independentemente em vários cavefish populações14,22. Portanto, cavefish fornecer um modelo para investigar a evolução convergente de sono, circadiano e comportamentos sociais.
Este protocolo descreve um sistema de medição do sono e comportamento locomotor na . mexicanus larvas e adultos. Um sistema de gravação baseado em infravermelho Custom-Built permite a gravação de vídeo de animais em condições claras e escuras. Software disponível comercialmente pode ser usado para medir a atividade e macros personalizadas são usadas para quantificar os diversos aspectos de inatividade e determinar os períodos de sono. Este protocolo descreve também modificações experimentais para controlar a atividade de vários animais dentro de um tanque, fornecendo a capacidade de analisar as interações entre o sono e comportamentos sociais. Estes sistemas podem ser aplicados a medida de sono, comportamento circadiano e atividade locomotora em espécies de peixe adicionais incluindo zebrafish e famílias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um sistema personalizado para quantificar o sono e a atividade locomotora em cavefish larval e adulto. Cavefish têm emergido como o principal modelo para o estudo da evolução do sono que pode ser usado para investigar a base genética e neural do sono Regulamento1. Os passos críticos neste protocolo incluem a otimização da iluminação e qualidade de vídeo para garantir a precisão de rastreamento que é necessária quantificar o sono. O sistema de aquisição e aná…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo prêmio NIGMS GM127872 ACK, NINDS prêmio 105072 ERD e ACK e prêmio NSF 1656574 de ACK.
Materials
| 12V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
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