Automatisert målinger av søvn og Locomotor aktivitet i meksikansk Cavefish
Summary
Denne protokollen detaljer metodikken for kvantifisere locomotor atferd og sove i den meksikanske cavefish. Tidligere analyser er utvidet for å måle disse atferd i sosialt plassert fisk. Dette systemet kan bli mye brukt for å studere søvn og aktivitet i andre fiskearter.
Abstract
Over rekker, er søvn preget av høyt konservert atferdsmessige egenskaper som inkluderer opphøyet opphisselsen etterpå fulgte søvnmangel og konsolidert perioder atferdsmessige ubevegelighet. Den meksikanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), er en modell for å studere egenskap utviklingen svar på miljømessige forstyrrelsene. A. mexicanus finnes i eyed overflaten-bolig-skjemaer og flere blind hulen-bolig populasjoner med robust morfologiske og atferdsmessige forskjeller. Søvn tap oppstod flere uavhengig utviklet cavefish bestander. Denne protokollen beskriver en metode for kvantifisering søvn og locomotor aktivitet i A. mexicanus cave og overflate fisk. En kostnadseffektiv video overvåking systemet tillater atferdsmessige imaging individuelt huses larver eller voksen fisk for perioder på en uke eller lenger. Systemet kan brukes fiske alderen 4 dager innlegget befruktning til voksen alder. Tilnærming kan også tilpasses for å måle effekten av sosial interaksjon på søvn ved flere fisk i en enkelt arena. Etter atferdsmessige innspillinger, dataene er analysert ved hjelp av automatisert sporing og sove analyse er behandlet ved hjelp av tilpassede skript som kvantifisere flere søvn variabler inkludert varighet, bout lengde og kamp nummer. Dette systemet kan brukes å mål søvn, circadian atferd og locomotor aktivitet i nesten alle fiskearter inkludert sebrafisk og sticklebacks.
Introduction
Søvn er svært bevart i hele dyreriket på nivåene fysiologiske, funksjonelle og atferdsmessige1,2,3. Mens søvn i pattedyr forsøksdyr er vanligvis vurdert ved hjelp electroencephalograms, elektrofysiologiske opptak er mindre praktisk i små genetisk mottagelig modellsystemer og dermed sove er vanligvis målt basert på atferd3 , 4. atferdsmessige egenskaper tilknyttet søvn er svært bevart i hele dyreriket og inkluderer økt opphisselsen, Reversibilitet med stimulering og langvarig atferdsmessige gågaten5. Disse tiltakene kan brukes å karakterisere søvn i dyr fra Rundormer ormen, C. elegans, til mennesker6.
Automatisk sporing krever bruk av atferdsmessige gågaten å karakterisere søvn. Med sporingsprogrammer, aktivitet og ubevegelighet bestemmes over flere dager, og lange perioder med inaktivitet er klassifisert som sove7,8. De siste årene, er flere sporingssystemer utviklet for å skaffe aktivitetsdata mellom et mangfold av små genetisk mottagelig modellsystemer; inkludert ormer, frukt fluer og fisk9,10,11. Disse programmene er ledsaget av programvare som tillater automatisk sporing av dyr atferd, inkludert åpen kildekode freeware og kommersielt tilgjengelig programvare7,12,13,14 . Disse systemene varierer i deres fleksibilitet og muliggjør effektiv screening og karakterisering av søvn fenotyper i mange genetisk amendable modeller.
Genetisk undersøkelse av søvn i sebrafisk, Danio rerio, har ført til identifisering av mange gener og nevrale kretser som regulerer sove15,16. Mens dette har gitt et kraftig system for å undersøke nevrale grunnlaget for søvn i en virveldyr laboratorium dyr, mye mindre er kjent om hvordan søvn utvikler seg og hvordan naturlige bidrar variasjon til sove regulering. Den meksikanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), har utviklet seg dramatisk forskjeller i søvn, locomotor aktivitet og døgnrytme17,18. Disse fiskene finnes som eyed overflate fisk som bor i elvene i Mexico og sørlige Texas og minst 29 cave befolkninger regionen Sierra Del Abra nordøst Mexico19,20,21. Bemerkelsesverdig, mange atferdsdata forskjeller, inkludert søvn tap, synes å ha dukket opp uavhengig i flere cavefish bestander14,22. Derfor gir cavefish en modell for konvergent evolusjon av søvn, circadian, og sosiale atferd.
Denne protokollen beskriver et system for å måle søvn og locomotor atferd i. mexicanus larver og voksne. Spesialbygde infrarød-basert opptak systemet tillater for video opptak av dyr under lyse og mørke forhold. Kommersielt tilgjengelig programvare kan brukes til å måle aktivitet og egendefinerte makroer brukes å kvantifisere flere aspekter ved inaktivitet og bestemme perioder med søvn. Denne protokollen beskriver også eksperimentelle endringer for å spore aktiviteten til flere dyr i en tank, gir muligheten til å undersøke interaksjoner mellom søvn og atferd. Disse systemene kan brukes å mål søvn, circadian atferd og locomotor aktivitet i flere fiskearter inkludert sebrafisk og sticklebacks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver et egendefinert system for kvantifisere søvn og locomotor aktivitet i larver og voksne cavefish. Cavefish har dukket opp som en ledende modell for å studere utviklingen av søvn som kan brukes til å undersøke genetiske og nevrale grunnlaget for søvn regulering1. De avgjørende skritt i denne protokollen inkluderer optimalisering av belysning og video kvalitet for å sikre nøyaktig sporing som er nødvendig å kvantifisere søvn. Systemet for oppkjøp og analyse be…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIGMS prisen GM127872 ACK, NINDS prisen 105072 ERD og ACK og NSF prisen 1656574 til bekreftelse
Materials
| 12V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
Referencias
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
- Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti, ., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
