Summary

Automatische metingen van slaap en motorische activiteit in Mexicaanse Cavefish

Published: March 21, 2019
doi:

Summary

Dit protocol detailleert de methodologie voor het kwantificeren van locomotor gedrag en slaap in de Mexicaanse cavefish. Eerdere analyses worden verlengd voor het meten van deze gedragingen in sociaal-gehuisvest vis. Dit systeem kan algemeen worden toegepast om te bestuderen van slaap en activiteit in andere vissoorten.

Abstract

Over stammen, wordt slaap gekenmerkt door zeer geconserveerde gedragsmatige kenmerken die verhoogde opwinding drempel opnemen, rebound na Slaapdeprivatie en geconsolideerde perioden van gedrags immobiliteit. De Mexicaanse cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), is een model voor het bestuderen van trait evolutie in antwoord op het milieu perturbation. A. mexicanus bestaan zoals in eyed oppervlak-woning vormen en meerdere blind grot-woning populaties die robuuste morfologische en gedrags-verschillen hebben. Slaap verlies opgetreden in meerdere, zelfstandig geëvolueerd cavefish populaties. Dit protocol beschrijft een methode voor het kwantificeren van de slaap en motorische activiteit in A. mexicanus grot en oppervlakte vissen. Een kosteneffectieve video monitoring systeem zorgt voor gedrags beeldvorming van individueel gehuisvest larvale of volwassen vis voor periodes van een week of langer. Het systeem kan worden toegepast om te vissen leeftijd 4 dagen post bevruchting tot volwassenheid. De aanpak kan ook worden aangepast voor het meten van de effecten van sociale interacties op de slaap door het opnemen van meerdere vis in een enkele arena. Na gedrags opnamen, gegevens wordt geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde software voor het bijhouden en slaap analyse wordt verwerkt met behulp van aangepaste scripts die meerdere slaap variabelen met inbegrip van duur, lengte van de bout en bout nummer kwantificeren. Dit systeem kan worden toegepast op de slaap van de maatregel, het circadiane gedrag en motorische activiteit in bijna alle vissoorten waaronder zebravis en Stekelbaarsachtigen.

Introduction

Slaap is zeer bewaard in het dierenrijk bij de gedrags, fysiologische en functionele niveaus1,2,3. Terwijl slapen in zoogdieren proefdieren is meestal beoordeeld met behulp van electroencephalograms, elektrofysiologische opnames zijn minder praktisch in kleine genetisch vatbaar modelsystemen en dus slaap wordt gewoonlijk gemeten op basis van gedrag3 , 4. gedragsmatige kenmerken die geassocieerd worden met slaap zijn zeer bewaard in het dierenrijk en verhoogde opwinding drempel, omkeerbaarheid met stimulatie en langdurige gedrags onbeweeglijkheid5omvatten. Deze maatregelen kunnen worden gebruikt om te karakteriseren slaap bij dieren variërend van de nematode worm, C. elegans, tot en met6van de mens.

Geautomatiseerde opsporingssoftware vereist het gebruik van gedrags onbeweeglijkheid te karakteriseren van de slaap. Met tracking software, periodes van activiteit en immobiliteit worden bepaald over een aantal dagen en lange periodes van inactiviteit zijn geclassificeerd als slapen7,8. In de afgelopen jaren zijn meerdere tracking-systemen ontwikkeld voor het verkrijgen van gegevens over de activiteit onder een verscheidenheid van kleine genetisch vatbaar modelsystemen; met inbegrip van wormen, fruitvliegjes en vissen9,10,11. Deze programma’s worden begeleid door software die voor de automatische opvolging van dierlijk gedrag zorgt, met inbegrip van zowel open source freeware en commercieel beschikbare software7,12,13,14 . Deze systemen verschillen in hun flexibiliteit en zorgen voor een efficiënte screening en karakterisering van slaap fenotypen in talrijke genetisch geamendeerd modellen.

Genetische onderzoek van slaap in de zebravis, Danio rerio, heeft geleid tot de identificatie van talrijke genen en neurale circuits die slaap15,16te regelen. Terwijl dit heeft op voorwaarde dat een krachtig systeem voor het onderzoeken van de neurale basis van slapen in een gewervelde proefdier, is veel minder bekend over hoe slaap evolueert en hoe natuurlijke variatie draagt bij aan de verordening te slapen. De Mexicaanse cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), geëvolueerd dramatische verschillen in slaap, motorische activiteit en circadiane ritmen17,18. Deze vissen bestaan zoals eyed oppervlakte vissen die het bewonen van de rivieren van Mexico en Zuid-Texas en ten minste 29 populaties rond de Sierra Del Abra regio Noordoost Mexico19,20,21 grot. Opmerkelijk, lijken veel gedrags verschillen, met inbegrip van verlies van de slaap, te onafhankelijk van elkaar zijn gegroeid in meerdere cavefish populaties14,22. Daarom bieden cavefish een model voor het onderzoeken van de convergente evolutie van slaap, circadiane, en sociaal gedrag.

Dit protocol beschrijft een systeem voor het meten van de slaap en motorische gedrag in A. mexicanus larven en volwassenen. Een op maat gemaakte infrarood gebaseerde opnamesysteem zorgt voor video-opname van dieren in lichte en donkere omstandigheden. Verkrijgbare software kan worden gebruikt voor het meten van de activiteit en aangepaste macro’s worden gebruikt om te kwantificeren van de verschillende aspecten van inactiviteit en perioden van slaap te bepalen. Dit protocol wordt ook beschreven experimentele wijzigingen voor het bijhouden van de activiteit van meerdere dieren binnen een tank, de mogelijkheid te onderzoeken van interacties tussen slaap en sociaal gedrag. Deze systemen kunnen worden toegepast op de slaap van de maatregel, het circadiane gedrag en motorische activiteit in extra vissoorten waaronder zebravis en Stekelbaarsachtigen.

Protocol

Opmerking: Systemen opzetten voor gedrags bijhouden in larven en volwassenen. 1. bouw een slaapsysteem voor larven Opmerking: Het monitoring systeem voor tracking larvale door jonge vis leeftijd 4 dagen post bevruchting (dpf) via 30 dpf A. mexicanus vereist meerdere stukken van materiaal met inbegrip van infrarood (IR) verlichting, acryl IR licht diffusors, geautomatiseerde licht besturingselementen (timers), computers, camera’s en secundaire…

Representative Results

Larven leeftijden die 4-30 dpf op betrouwbare wijze kan worden opgenomen in de aangepaste-build gesloten systeem zoals beschreven in Figuur 1. Het systeem omvat zowel IR en zichtbare verlichting toe te staan voor opnamen in lichte en donkere omstandigheden, onder verschillende omstandigheden met zichtbaar licht (figuur 1A). De video’s worden vervolgens geanalyseerd met behulp van opsporingssoftware (figuur 1B…

Discussion

Dit protocol beschrijft een aangepast systeem voor het kwantificeren van de slaap en de motorische activiteit in larvale en volwassen cavefish. Cavefish opgedoken als een toonaangevende model voor het bestuderen van de evolutie van slaap dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de genetische en neurale basis van slaap voorschrift1. De kritische stappen in dit protocol omvatten de optimalisatie van verlichting en video kwaliteit te verzekeren nauwkeurige tracking die nodig is om te kwantifi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door NIGMS award GM127872 ACK, NINDS award 105072 ERD en ACK, en NSF award 1656574 naar ACK

Materials

12V power adaptor Environmental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Acrylic dividers (adults) TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Adult infrared light power source Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Battery pack CyberPower CP850PFCLCD
Camera lens (adult) Navitar Zoom 7000 Zoom 7000
Camera lens (larval) Fujian 35mm f/1.7 B01CHX7668 Purchase on Amazon
Camera lens adapter d 1524219
Camera mount CowboyStudio Super Clamp B002LV7X1K Purchase on Amazon
Fish tank Deep Blue Professional ADB11006
Heat sink (adult) M-D Building products SKU: 61085 Cut to fit
Heat sink (larval) M-D Building products SKU: 57000 Cut to fit
Infrared lights (adults) Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip irrf850-5050-60-reel Cut to fit
Infrared lights (larval) LED World B00MO9H7H4 Purchase on Amazon
IR-diffusing acrylic TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Laptop/computer N/A N/A Any laptop will work.
LED light Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) B06XKTRSP7 Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel
light timer Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded
Plastic wall mount for IR Everbilt Plastic pegboard Model # 17961
Power cable BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire B01K4RPE0Y
Power source Rapid LED MOONLIGHT DRIVER (350MA)
Tissue culture plates Fisherbrand 12-well (FB012928) 24-well (FB012929)
Tripod Ball head Demon DB-44 B00TQ54CZO Purchase on Amazon
USB Hardrive Seagate 3TB backup STDT3000100
USB Webcam Microsoft LifeCam Q2F-00014 Purchase on Amazon
Wall mount for camera LDR Industries 1/2" Steel pipe 307 12X36 Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera.

Referencias

  1. Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
  2. Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
  3. Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
  4. Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
  5. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
  6. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  7. Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
  8. Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
  9. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  10. Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
  11. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  12. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
  13. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
  14. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
  15. Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
  16. Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  17. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
  18. Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
  19. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  20. Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  21. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  22. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
  23. Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
  24. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
  25. Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  26. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti, ., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  27. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
  28. Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
  29. Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
  30. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
  31. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  32. Bell, M. A., Foster, S. A. . The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, (1994).
  33. Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
  34. Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
check_url/es/59198?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (145), e59198, doi:10.3791/59198 (2019).

View Video