Automatiserede målinger af søvn og bevægeapparatet aktivitet i mexicansk Cavefish
Summary
Denne protokol beskriver metoden til kvantificering af bevægeapparatet adfærd og sove i den mexicanske cavefish. Tidligere analyser er udvidet til at måle disse adfærdsmønstre hos socialt opstaldede fisk. Dette system kan anvendes bredt til at studere søvn og aktivitet i andre fiskearter.
Abstract
På tværs af phyla, er søvn kendetegnet ved stærkt bevarede adfærdsmæssige karakteristika, der omfatter forhøjede arousal tærskel, rebound efter søvnmangel og konsolideret perioder af adfærdsmæssige immobilitet. Den mexicanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), er en model til at studere træk evolution som reaktion på miljømæssige undertrykkelse af netbårne. A. mexicanus findes i eyed overflade-bolig former og flere blinde hulen-boligen befolkninger, der har robuste morfologiske og adfærdsmæssige forskelle. Søvn tab der er opstået i flere, selvstændigt udviklet cavefish populationer. Denne protokol beskriver en metode til kvantificering af søvn og bevægeapparatet aktivitet i A. mexicanus hule og overflade fisk. En omkostningseffektiv video aflytning ordning giver mulighed for adfærdsmæssige billeddannelse af individuelt opstaldede larve eller voksne fisk for perioder på en uge eller længere. Systemet kan anvendes til at fiske alderen 4 dage post befrugtning gennem voksenalderen. Metoden kan også tilpasses til at måle virkningerne af sociale interaktioner på søvn ved at optage flere fisk i en enkelt arena. Efter adfærdsmæssige optagelser og data er analyseret ved hjælp af automatiserede software til sporing og søvn analyse er behandlet ved hjælp af brugerdefinerede scripts, at kvantificere flere søvn variabler herunder varighed, bout længde og bout antallet. Dette system kan anvendes til foranstaltning søvn, døgnrytmen adfærd og bevægeapparatet aktivitet i næsten enhver fiskearter, herunder zebrafisk og hundestejler.
Introduction
Søvn er meget bevaret i hele dyreriget på fysiologiske, funktionelle og adfærdsmæssige niveauer1,2,3. Mens søvn i pattedyr forsøgsdyr vurderes typisk ved hjælp af electroencephalograms, elektrofysiologiske optagelser er mindre praktisk i lille genetisk medgørlige modelsystemer og dermed søvn måles typisk baseret på adfærd3 , 4. adfærdsmæssige karakteristika forbundet med søvn er meget bevaret i hele dyreriget og omfatter øget ophidselse tærskel, reversibilitet med stimulering og langvarig adfærdsmæssige ubevægelighed5. Disse foranstaltninger kan anvendes til at karakterisere søvn hos dyr lige fra den nematodeprøveudtagning orm, C. elegans, gennem mennesker6.
Brugen af adfærdsmæssige ubevægelighed at karakterisere søvn kræver automatiske tracking software. Med tracking software, perioder med aktivitet og immobilitet bestemmes over flere dage, og lange perioder med inaktivitet er klassificeret som sover7,8. I de seneste år, er flere tracking-systemer blevet udviklet for at erhverve aktivitetsdata blandt en mangfoldighed af små genetisk medgørlige modelsystemer; herunder orme, bananfluer og fisk9,10,11. Disse programmer er ledsaget af software, der giver mulighed for automatisk sporing af animalsk opførsel, herunder både open source freeware og kommercielt tilgængelige software7,12,13,14 . Disse systemer er forskellige i deres fleksibilitet og giver mulighed for effektiv screening og karakterisering af søvn fænotyper i talrige genetisk ændres modeller.
Genetiske undersøgelser af søvn i zebrafisk, Danio rerio, har ført til identifikation af mange gener og neurale kredsløb, der regulerer søvn15,16. Mens dette har givet et kraftfuldt system til undersøgelse af det neurale grundlag af søvn i en hvirveldyr laboratory animal, er langt mindre kendte om hvordan søvn udvikler sig og hvordan naturlige bidrager variation til at sove forordning. Den mexicanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), har udviklet sig dramatisk forskelle i søvn, bevægeapparatet aktivitet og døgnrytmen17,18. Disse fisk findes som eyed overflade fisk, der lever i floder i Mexico og det sydlige Texas og mindst 29 cave befolkninger rundt om regionen Sierra Del Abra nordøstlige Mexico19,20,21. Bemærkelsesværdigt, mange adfærdsmæssige forskelle, herunder søvn tab, synes at have opstået uafhængigt i flere cavefish populationer14,22. Derfor giver cavefish en model for at undersøge konvergent evolution af søvn, døgnrytmen, og social adfærd.
Denne protokol beskriver et system til måling af søvn og bevægeapparatet adfærd i A. mexicanus larver og voksne. Et specialbygget infrarød-baserede optagelse system giver mulighed for videooptagelse af dyr under lys og mørke. Kommercielt tilgængelige software kan bruges til at måle aktivitet og brugerdefinerede makroer bruges til at kvantificere flere aspekter af inaktivitet og bestemme perioder af søvn. Denne protokol beskriver også eksperimentelle ændringer til sporing af aktiviteten af flere dyr i en tank, giver mulighed for at undersøge interaktioner mellem søvn og social adfærd. Disse systemer kan anvendes til foranstaltning søvn, døgnrytmen adfærd og bevægeapparatet aktivitet i yderligere fiskearter, herunder zebrafisk og hundestejler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en brugerdefineret system for kvantificering af søvn og bevægeapparatet aktivitet i larve og voksen cavefish. Cavefish er dukket op som en førende model til at studere udviklingen af søvn, der kan bruges til at undersøge den genetiske og neurale grundlag af søvn forordning1. De afgørende skridt i denne protokol omfatter optimering af belysning og video kvalitet for at sikre præcis sporing, er nødvendigt at kvantificere søvn. System for erhvervelse og analyse besk…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF award 1656574 til ACK. NIGMS award GM127872 ACK og NINDS award 105072 ERD og ACK
Materials
| 12V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
Referencias
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
- Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti, ., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
