מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי
Summary
כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של > 1,000 TFs בניסוי יחיד.
Abstract
זיהוי קבוצות גורמי שעתוק (TFs) המסדירים כל הגן האנושי היא משימה מרתיעה הדורש שילוב של גישות ניסוייות וחישוביות רבים. שיטה אחת כזו היא וזמינותו (Y1H) אחד-היברידית שמרים, באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב גנים. מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על “ה-DNA-פיתיון’ (למשל., היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו ‘), ‘TF-טרף,’ אשר יכולים להיות מוקרן על הפעלת גנים כתב. ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מסכי Y1H מבוססים על להפוך ספריות TF-טרף או מערכים זני שמרים DNA-פיתיון. כאן, אנו מתארים צינור, שנקרא Y1H משופרת (eY1H) מבחני, איפה TF-DNA אינטראקציות הם שנחקרו על-ידי הזדווגות זנים DNA-הפיתיון עם אוסף ערוכים של זנים TF-טרף באמצעות מערך צפיפות גבוהה פלטפורמה רובוטית (HDA) המאפשר הקרנה ב- 1536 תבנית של המושבה. דבר זה מאפשר עלייה דרמטית בערך תפוקה (רצפי DNA-פיתיון 60 נגד > 1,000 TFs לוקח שבועיים לכל חוקר) ו הפארמצבטית. אנו מדגימים סוגים שונים של התוצאות הצפויות על-ידי בדיקת יזם האנושי רצפים נגד מערך של 1,086 TFs האנושית, כמו גם דוגמאות של בעיות שעשויות להתרחש במהלך מסכי וכיצד לפתור אותם.
Introduction
בעיה מרכזית בתחום הביו-רפואי הוא בקביעת המנגנון שבאמצעותו מוסדר כל הגן האנושי. תמלול היא הצעד הראשון בשליטה על רמות ביטוי גנים, זה מוסדר על ידי קבוצות של גורמי שעתוק (TFs) ייחודיים לכל הגנים. נתון כי בני אדם קידוד עבור > 1,500 TFs1,2, המזהה את הערכה המלאה של TFs השולטים הביטוי של כל הגן נותר אתגר פתוח.
שני סוגים של שיטות יכול לשמש כדי למפות TF-DNA אינטראקציות: שיטות ממורכז TF וממורכז הדנ א3 (איור 1 א’). בשיטות TF ממורכז, TF עניין הוא נחקר עבור איגוד לאזורים דנ א גנומי או כדי לקבוע שלה ירידה לפרטים איגוד ה-DNA. שיטות אלה כוללות immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ואחריו רצף תפוקה גבוהה, מיקרו-מערכים מחייב חלבון ו- SELEX4,5,6. בשיטות ממורכז דנ א, רצף ה-DNA של עניין הוא נחקר כדי לקבוע את קבוצת שר זה לאגד רצף ה-DNA. אפלייד נרחב ביותר של שיטות כאלה היא מבחני שמרים אחד-היברידית (Y1H), באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב הגנים7,8,9.
מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על “ה-DNA-פיתיון’ (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו ‘), ‘TF-טרף,’ אשר יכולים להיות מוקרן כתב ג’ין הפעלה9,10 (איור 1B). דנ א-הפיתיון שוכפל במעלה הזרם של כתב שני גנים (LacZ ו HIS3) וקבועים DNA-bait::reporter שני משולבים לתוך הגנום שמרים ליצירת chromatinized ‘DNA-פיתיון זנים.’ TF-הטרף, המקודדת על פלסמיד המבטאת של TF התמזגו לתחום הפעלה (AD) של השמרים Gal4 TF, מוחדרים המתח DNA-פיתיון לדוג עבור אינטראקציות TF-DNA. אם TF-הטרף נקשר רצף ה-DNA-פיתיון, ואז המודעה נוכח TF-הטרף יוביל להפעלת שתי גנים כתב. כתוצאה מכך, תאים עם השפעה חיובית הדדית יכול להיות שנבחר עבור הצמיחה על צלחות חסר היסטידין, כמו גם התגברות על מעכב תחרותי, 3-אמינו-1,2,4-triazole (3-AT), דמיינו כמו מושבות כחול בנוכחות X-גל. כי חזק שמרים Gal4 לספירה משמש, מבחני Y1H יכול לזהות אינטראקציות מעורבים activators תעתיק וכן repressors. בנוסף, לאור העובדה TF-הטרף באים לידי ביטוי של מקדם חזק שמרים (ADH1), ניתן להבחין אינטראקציות אפילו בשביל TFs בעלי רמות ביטוי אנדוגני נמוכה, אשר הם מאתגרים לזהות על-ידי שבב11,12.
ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מבחני Y1H מבוססים על ידביקו TF-הטרף זנים DNA-פיתיון שמרים בהפיכת ספריות TF-טרף במאגר עקב בחירה, המושבה איסוף, ורצף כדי לזהות את TF אינטראקציה, או על ידי שינוי צורה של הפרט שיבוטים8,9. אלה הם פרוטוקולי גוזלת זמן, הגבלת מספר רצפי דנ א יכול להיבדק לכל חוקר. שיפור האחרונות של מבחני Y1H, שנקרא משופרת Y1H (eY1H), גדל באופן דרמטי את התפוקה הקרנה באמצעות פלטפורמה רובוטית של המערך (HDA) צפיפות גבוהה להזדווג זני שמרים DNA-הפיתיון עם אוסף של זני שמרים כל ביטוי שונה TF-טרף10,13 (איור 1C). המסכים הבאים מעסיקים של המושבה 1,536 פורמט המאפשר מבחן TFs האנושי ביותר באמצעות לוחות רק שלוש ארבע פעמים. עוד יותר, בהתחשב בעובדה TF-DNA אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, גישה זו מאפשרת להשוואת אינטראקציות בין DNA-פיתיונות (כגון שתי גרסאות noncoding נוקלאוטיד יחיד) ובין שר אחר או TF גרסאות11,12 ,14.
באמצעות מבחני eY1H, לנו יש מאפשרת את האדם הגדול ואת Caenorhabditis elegans ממורכז DNA TF-DNA אינטראקציות רשתות עד היום. בפרט, זיהינו 2,230 אינטראקציות בין 246 משפרי התפתחותית האנושי 283 TFs12. יתר על כן, יש לנו עובדים eY1H מבחני לחשוף מחייב TF שינו 109 נוקלאוטיד יחיד noncoding משתנים הקשורים עם מחלות גנטיות כגון מום התפתחותית, סרטן, הפרעות נוירולוגיות. לאחרונה, השתמשנו eY1H על רשת הכוללת 21,714 אינטראקציות בין היזמים ג’ין C. elegans 2,576 366 TFs11. רשת זו הייתה לחשוף את תפקיד פונקציונלי של עשרות TFs C. elegans .
הפרוטוקולים להפיק DNA-פיתיון כתמי ולהעריך את הרמות של פעילות עיתונאית הרקע היה דיווח במקום אחר15,16,17. כאן, אנו מתארים של צינור eY1H יכול לשמש למסך בכל אזור דנ א גנומי האנושי נגד מערך של 1,086 TFs אנושי. ברגע שמרים DNA-פיתיון המתח נוצר מערך TF-טרף ניצפית על גבי הלוחות המתאימים, ניתן לבצע פרוטוקול כולו בעוד שבועיים (טבלה 1). וחשוב מכך, יכול להיות parallelized הפרוטוקול כך חוקר יחיד. באפשרותך לסנן רצפי DNA-פיתיון 60 בו זמנית. כדי להדגים את הפרוטוקול, הוקרנו היזמים של שני גנים ציטוקינים CCL15 ו- IL17F. בנוסף, אנו מראים תוצאות המסכים שנכשלו להמחשת סוגי הבעיות שעלולות להתעורר בעת ביצוע מבחני eY1H וכיצד לפתור אותם.
Protocol
Representative Results
Discussion
EY1H רובוטית ההזדווגות ההקרנה הגישה המתוארת כאן במידה רבה מגדילה את התפוקה כדי לזהות את קבוצת TFs לאגד לאזור ה-DNA של עניין, לעומת ההקרנה ספריה הקודמים או הקרנה ערוכים גישות המבוסס על שינוי. יתר על כן, את האינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H מבחני הם מאוד לשחזור, כמו 90% של אינטראקציות שזוהו הן חיובית …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R35-GM128625 כדי J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Referencias
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
