Индукция и скоринг трансплантата-Versus-Host болезни в Xenogeneic Murine модели и количественной оценки человеческих Т-клеток в мышь тканей с помощью цифровых ПЦР

Аллогенная гематопоатическая трансплантация стволовых клеток (HSCT) стала рутинным лечением для пациентов, страдающих гематологическими злокачественными новообразованиями, такими как лейкемия с плохим прогнозом. Значительным осложнением ВпГТ является острая трансплантата против принимающей болезни (GVHD). Исследование 2012 года сообщило, что острый GVHD разработан в 39% пациентов HSCT, получающих трансплантации от братьев и сестер доноров и 59% пациентов, получающих трансплантации от неродственных доноров¹. Острый GVHD происходит, когда полученные донором Т-клетки атакуют органы реципиента. Единственной успешной терапией Для GVHD являетсялечение высокоиммуносупрессивными препаратами 2, которые являются высокотоксичными и повышают риск заражения и рецидива опухоли. Таким образом, несмотря на улучшения, которые были сделаны в острой выживания GVHD в последние годы^3,4,5, есть еще критическая потребность в улучшении Терапии GVHD с минимальной токсичностью, которые способствуют долгосрочной ремиссии.

Общая цель следующих методов заключается в том, чтобы побудить и забить ксеногенных GVHD (xenoGVHD). Модель xenoGVHD была разработана как инструмент для индуцирования острого GVHD с человеческими клетками, а не murine клетки, что позволяет более прямой перевод доклинических исследований GVHD клинических испытаний⁶. Эта модель включает в себя внутривенно инъекционные человеческие периферические клетки крови (PBMC) в NOD-SCID IL-2R null (NSG) мышей, которые сублетально облучены. Введенные т-клетки человека активируются человеческими антигенами, представляющими клетки (APCs), представляющие антиген мурин,и активированные Т-клетки мигрируют в отдаленные ткани, что приводит к системному воспалению и, в конечном счете, смерти 6,^{7, 8 , 9 До 9 , 10}. Патология болезни и прогрессирование в модели xenoGVHD тесно имитируют острое ГВГД человека. В частности, патогенные человеческие Т-клетки реагируют на мурин основных гистосовместимости комплекса (MHC) белков, который похож на т-клеток аллелореактивность в человека GVHD^6,9. Основным преимуществом модели xenoGVHD по сравнению с моделью мыши MHC-mismatch, другой широко используемой моделью GVHD, является то, что она позволяет проводить тестирование терапии на клетках человека, а не на моринклетках. Это позволяет для тестирования продуктов, которые могут быть непосредственно переведены в клинику без каких-либо изменений, потому что они сделаны для целевой человеческих клеток. Недавно эта модель была использована для тестирования человека анти-IL-2 антитела¹¹, человека тимических регуляторных Т-клеток (Tregs)¹² и человека мезенхимальных стволовых клеток¹³ в качестве потенциального лечения острой GVHD. В более широком контексте, эта модель может быть использована в качестве in vivo подавления асссы для любого препарата или типа клеток, которые могут подавить активность Т-клеток человека. Например, Stockis et al.¹⁴ использовали модель xenoGVHD для изучения влияния блокирования интергрина ЗВЗ8 на супрессивную активность Treg in vivo. Таким образом, модель xenoGVHD может дать представление о механизме любой терапии, ориентированной на Т-клетки в условиях in vivo.

Дополнительный метод, описанный в этом протоколе, заключается в том, как обнаружить Т-клетки человека в тканях мыши с помощью цифровой цепной реакции полимеразы (dPCR). Цель этого метода заключается в том, чтобы предложить инструмент для количественной оценки миграции и распространения Т-клеток в целевых тканях, которые измеряют эффективность иммуносупрессивных методов лечения, тестируемых в этой модели. dPCR является относительно новым методом количественной оценки нуклеиновых кислот¹⁵. Короче говоря, смесь реакции ПЦР делится на разделы, которые содержат небольшое количество целевой последовательности или вообще не нацелена. Затем целевая последовательность усиливается и обнаруживается с помощью интеркалирующихся красителей ДНК или флуоресцентных целевых зондов. dPCR количественно количество копий целевой последовательности на основе доли положительных разделов и статистики Пуассона^15,16. Обнаружение Т-клеток с dPCR требует гораздо меньше ткани по сравнению с другими альтернативными методами, включая цитометрию потока и гистологии, и может быть выполнена на замороженных или фиксированных тканей. dPCR не требует стандартной кривой для определения номеров копий, равно как и не требуется техническая реплика. Это уменьшает количество реагента и шаблона ДНК, необходимых для dPCR по сравнению с традиционными количественными ПЦР (qPCR)¹⁶. Раздел реакции ПЦР на субреакции в dPCR эффективно концентрирует цели^17. Таким образом, dPCR является в первую очередь инструментом для обнаружения редких целей в большом количестве нецелевой ДНК. Например, dPCR используется для обнаружения бактериального загрязнения в молоке¹⁸, выявления редких мутаций в гене рецептора эстрогена¹⁹, и обнаружить циркулирующую ДНК опухоли в крови пациентов²⁰. В этом протоколе dPCR служит эффективным инструментом для обнаружения и количественной оценки Т-клеток человека в тканях мышей с ксеноГВД.