Induktion og scoring af graft-versus-Host-sygdom i en xenogen Murinmodel og kvantificering af humane T-celler i muse væv ved hjælp af digital PCR

Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) er blevet rutinemæssig behandling for patienter, som lider af hæmatologiske maligniteter såsom leukæmi med dårlig prognose. En signifikant komplikation af HSCT er akut graft-versus-Host-sygdom (GVHD). En 2012 undersøgelse rapporterede, at akut GVHD udviklet i 39% af HSCT patienter, der modtager transplantationer fra søskende donorer og 59% af patienter, der modtager transplantationer fra ikke-forretningsmæssigt forbundne donorer¹. Akut GVHD opstår, når donor-afledte T-celler angriber modtagerens organer. Den eneste vellykkede behandling for GVHD er behandling med meget Immunsuppressive lægemidler², som er meget giftige og øger risikoen for infektion og tumor gentagelse. På trods af forbedringer, der er foretaget i akut gvhd overlevelse i de seneste år^3,4,5, er der stadig et kritisk behov for forbedrede gvhd-terapier med minimal toksicitet, der fremmer langsigtet remission.

Det overordnede mål med følgende metoder er at inducere og score xenogene gvhd (xenogvhd). XenoGVHD-modellen blev udviklet som et værktøj til at inducere akut GVHD med humane celler i stedet for murinceller, der giver mulighed for mere direkte oversættelse af præklinisk GVHD-forskning til kliniske forsøg⁶. Denne model involverer intravenøst injiceret humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus, der er sublethally bestrålet. Injicerede humane t-celler aktiveres af humane antigen præsentations celler (apc’er), der præsenterer murin-antigen, og de aktiverede t-celler migrerer til fjernt væv, hvilket resulterer i systemisk inflammation og i sidste ende død^{6,7, 8 , 9 , 10}. sygdoms patologi og progression i xenoGVHD-modellen nøje efterligner humant akut gvhd. Specifikt er de patogene humane T-celler reaktive over for murine Major komplekse Complex (MHC) proteiner, som svarer til T-cellens alloreactivity i human gvhd^6,9. Den primære fordel ved xenoGVHD-modellen over musens MHC-mismatch-model, den anden udbredte GVHD-model, gør det muligt at teste terapier på humane celler i stedet for murinceller. Dette giver mulighed for afprøvning af produkter, der direkte kan oversættes til klinikken uden ændringer, fordi de er lavet til at målrette humane celler. For nylig er denne model blevet brugt til at teste et humant anti-IL-2 antistof¹¹, humane thymiske regulatoriske T-celler (Tregs)¹² og humane mesenchymale stamceller¹³ som potentielle behandlinger for akut gvhd. I en bredere sammenhæng, denne model kan bruges som en in vivo suppression analyse for enhver stof eller celletype, der kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. F. eks. brugte stockis et al.¹⁴ xenogvhd-modellen til at undersøge effekten af blokering af anti αvβ8 på treg suppressiv aktivitet in vivo. Derfor kan xenoGVHD-modellen give indsigt i mekanismen i enhver terapi, som målretter mod T-celler i en in vivo-indstilling.

En yderligere metode beskrevet i denne protokol er, hvordan man opdager humane T-celler i mus væv ved hjælp af digital polymerase kædereaktion (dPCR). Målet med denne metode er at tilbyde et værktøj til at kvantificere migration og spredning af T-celler i målvæv, som måler effekten af immunosuppressive behandlinger, der testes i denne model. dPCR er en forholdsvis ny metode til kvantificering af nukleinsyrer¹⁵. Kort sagt er PCR-reaktionsblandingen opdelt i partitioner, der indeholder små tal af målsekvensen eller intet mål overhovedet. Målsekvensen forstærkes og detekteres ved hjælp af DNA-interkalerende farvestoffer eller fluorescerende målspecifikke sonder. dpcr kvantificerer antallet af kopier af Target sekvens baseret på brøkdel af positive partitioner og Poissons statistik^15,16. Påvisning af T-celler med dPCR kræver meget mindre væv sammenlignet med andre alternative metoder, herunder flow cytometri og histologi, og kan udføres på frosset eller fast væv. dPCR kræver ikke en standardkurve for at bestemme kopi numre, og der kræves heller ikke tekniske replikater. Dette reducerer mængden af reagens og skabelon-DNA, der er nødvendigt for dPCR sammenlignet med traditionel kvantitativ PCR (qPCR)¹⁶. Opdeling af PCR-reaktionen i sub-reaktioner i dPCR koncentrerer mål¹⁷. DPCR er således primært et værktøj til påvisning af sjældne mål i en stor mængde ikke-måldna. For eksempel bruges dPCR til at påvise bakteriel kontaminering i mælk¹⁸, identificere sjældne mutationer i østrogen receptor genet¹⁹og detektere cirkulerende tumor DNA i blodet hos patienter²⁰. I denne protokol fungerer dPCR som et effektivt værktøj til påvisning og kvantificering af humane T-celler i væv hos mus med xenoGVHD.