Summary

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

Um método quantitativo foi desenvolvido para identificar e prever a toxicidade aguda de substâncias químicas, analisando automaticamente a caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans. Este protocolo descreve como tratar vermes com produtos químicos em uma placa de 384, capturar vídeos e quantificar toxicológicos fenótipos relacionados.

Abstract

Aplicação de testes de toxicidade de produtos químicos em organismos superiores de ordem, tais como ratos ou ratos, é demorado e caro, devido a sua longa vida útil e problemas de manutenção. Pelo contrário, o nematódeo Caenorhabditis elegans (c. elegans) tem vantagens para torná-lo uma escolha ideal para o teste de toxicidade: uma vida curta, fácil cultivo e reprodução eficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para a perfilação fenotípica automática de c. elegans em uma placa de 384. Os vermes nematoides são cultivados em uma placa de 384 com tratamento líquido médio e química, e vídeos são tomados de cada poço para quantificar a influência química em 33 características de worm. Resultados experimentais demonstram que as características do fenótipo quantificados podem classificar e prever a toxicidade aguda por compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais testes de avaliação de toxicidade química tradicional em um modelo de roedor.

Introduction

Juntamente com o rápido desenvolvimento de compostos químicos aplicados à produção industrial e o cotidiano das pessoas, é importante estudar a toxicidade testando modelos para os produtos químicos. Em muitos casos, o modelo animal roedor é empregado para avaliar a toxicidade potencial de diferentes substâncias químicas na saúde. Em geral, a determinação da concentração letal (i.e., a analisado 50% dose letal [LD50] de produtos químicos diferentes) é usada como o parâmetro tradicional em um modelo de roedores (rato/mouse) in vivo que é muito caro e demorado. Além disso, devido a reduzir, refinar, ou substituir o princípio (3R) que é central à ética e ao bem-estar dos animal, novos métodos que permitem a substituição de animais superiores são valiosos para a pesquisa científica1,2,3 . C. elegans é um nemátodo de vida livre que foi isolado do solo. Ele foi amplamente utilizado como um organismo de investigação no laboratório por causa de suas características benéficas, tais como um tempo de vida curto, fácil cultivo e reprodução eficiente. Além disso, muitos caminhos biológicos fundamentais, incluindo os processos fisiológicos básicos e respostas de estresse em c. elegans, são conservados no maior mamíferos4,5,6,7 , 8. em algumas comparações que nós e os outros fizeram, há uma boa concordância entre a toxicidade de c. elegans e a toxicidade observada em roedores9. Tudo isso faz c. elegans , um bom modelo para testar os efeitos da toxicidade química in vivo.

Recentemente, alguns estudos quantificar as características fenotípicas de c. elegans. Os recursos podem ser usados para analisar a toxicidade dos produtos químicos,2,3,10 e o envelhecimento dos vermes11. Também desenvolvemos um método que combina um verme líquido cultivo sistema e um sistema de análise de imagem, na qual os vermes são cultivados em uma placa de 384 sob diferentes tratamentos químicos12. Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de c. elegans após 12-24h de tratamento químico em uma placa com meio líquido de 384. Numa fase de microscópio automatizado é usada para aquisição de vídeo experimental. Os vídeos são processados por um programa de design personalizado, e 33 características relacionadas ao comportamento em movimento dos vermes são quantificadas. O método é usado para quantificar os fenótipos de worm sob o tratamento de 10 compostos. Os resultados mostram que a toxicidades diferentes podem alterar os fenótipos de c. elegans. Estes fenótipos quantificados podem ser usados para identificar e prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos. O objectivo geral deste método é para facilitar a observação e quantificação fenotípica de experimentos com c. elegans em uma cultura líquida. Este método é útil para a aplicação do c. elegans em avaliações de toxicidade química e quantificações de fenótipo, que ajudam a prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais tradicional testes de avaliação da toxicidade química em um modelo de roedor. Além disso, esse método pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos ou o composto, como a poluição de agente aditivo de alimento pharmacautical compostos, compostos exógenos ambiental e assim por diante.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de ética Animal, do centro de Pequim para prevenção de doenças e controle na China. 1. química preparação Obter produtos químicos (tabela 1 e Tabela de materiais). Determine a maior e menor dosagem dos produtos químicos individuais para uma concentração mínima de letalidade de 100% (LC100, 24 h) e uma concentração máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) para v…

Representative Results

Nós testamos os fenótipos de vermes expostos a diferentes concentrações de mais de 10 produtos químicos12. No teste, 33 características distintas foram quantificadas para cada produto químico composto em três pontos de tempo (0 h, 12 h e 24 h). Uma comparação entre um manual e uma análise automática de um ensaio de vida útil foi feita previamente,11,12. Neste ensaio, encontramos que os produtos…

Discussion

As vantagens de c. elegans levaram-se a sua crescente utilização em toxicologia9, tanto para estudos mecanicistas e abordagens de seleção da elevado-produção. Um papel acrescido para c. elegans em complementando outros sistemas modelo na pesquisa toxicológica tem sido notável nos últimos anos, especialmente para a avaliação da toxicidade rápida de novas substâncias químicas. Este artigo fornece um novo ensaio de triagem elevado-throughput, quantitativo de worm fenó…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer CGC gentilmente enviar o c. elegans. Este trabalho foi apoiado pela nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fundação Nacional de ciências naturais da China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), a Capital de saúde pesquisa e desenvolvimento de projeto especial em Pequim (#2011-1013-03), o fundo da abertura do Beijing chave laboratório de toxicologia ambiental (# 2015HJDL03) e a Fundação de ciências naturais da província de Shandong, China (ZR2017BF041).

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

Referencias

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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