Summary

Новый портативный в Vitro экспозиции кассета для аэрозольных проб

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения портативный сотовый аэрозольных воздействий и измерить клеточный ответ. Данный метод использует клетки, выращенных на интерфейсе воздуха жидкость, подражая физиологии в естественных условиях . Клеточный ответ на медь наночастиц аэрозоли было отмечено как Оксидативный стресс через реактивнооксигенных видов генерации и цитотоксичность как лактатдегидрогеназа релиз.

Abstract

Этот протокол вводит новый в vitro воздействия системы, способной носили, включая его квалификации и производительности. Воздух жидкий интерфейс (Али) в vitro воздействия системы часто большие и громоздкие, затрудняя транспорта на местах и операции на источнике выбросов или в зоне дыхания. Через миниатюризация этих систем лаборатории может быть доставлен на местах, ускорить время обработки и предоставления более подходящим метод воздействия, который не меняет аэрозоля до обращения клетки. Переносные в vitro экспозиции кассеты (PIVEC) адаптирует Кассетный фильтр 37 мм для тестирования вне традиционных лабораторных условиях токсичности в пробирке . PIVEC был охарактеризован с помощью трех размеров наночастиц меди для определения эффективности осаждения на основании гравиметрических и числовой анализ концентрации частиц. Были проведены эксперименты первоначальный цитотоксичности клетки подвергаются легких для определения способности системы на хранение частиц при сохранении жизнеспособности клеток. PIVEC обеспечивает эффективность подобных или увеличение осаждения при сравнении доступны перпендикулярно потока в vitro воздействия устройства. Несмотря на нижней образца пропускной способности малый размер дает некоторые преимущества для текущей в vitro Али воздействия систем. К ним относятся возможность носить для персонального мониторинга, мобильность из лаборатории на источник выбросов, и возможность настройки нескольких систем для пространственного разрешения при сохранении ниже пользователя стоимость. PIVEC является системой, способной сбора аэрозолей в поле и в зоне дыхания на воздух интерфейсом, в пробирке модель.

Introduction

Личные выборки с использованием методов в пробирке может предоставить всеобъемлющую информацию о биологических эффектов аэрозолей на рабочем месте. 1 воздействия загрязнителей в воздухе включают воздействия химических, собранных воздуха пробы, в подводных условиях, где газ вводится в суспензии клеток, прерывистый воздействия, с помощью устройства, такие как рокер, или прямой воздействия на интерфейсе воздуха жидкость (Али). 2 многие из этих методов выполняются с клетками, выращенных в подвеска или коллекции образцов до воздействия, каждый из которых может повлиять на токсикологические исследования из-за возможных изменений в аэрозоль. 3 чтобы избежать этих изменений, лаборатории могут быть доведены до поля, используя несколько в vitro Али культуры воздействия систем, которые используются в литературе,,4,5,6,7 8,9,10,11,12,13 однако, лишь немногие являются коммерчески доступными. 8 , 9 , 12 эти системы часто громоздки, особенно когда включая инструменты для регулирования температуры и влажности клеточной среды и скорость потока аэрозоля образца. С помощью PIVEC, воздействия аэрозолей может выполняться за пределами традиционных лабораторных условиях или в зоне дыхания во время имитируя условий ингаляции.

Определение аэрозольного осаждения в vitro имеет важное значение для расследования последствий для здоровья вследствие вдыхания. В зоне дыхания, район, в пределах 30 см от рот и нос,14 решающее значение для понимания воздействия наночастиц и увязки биологических эффектов в легких. 2 часто, осаждения на клетки определяется как эффективности осаждения частиц на и принятые клеток, разделенных частицы, управляемые системы6,15 или на массовой основе те же суммы. 4 , 16 текущие методы для измерения аэрозолей в зоне дыхания являются фильтр на основе, захват частиц в течение заданного выборки и использования фильтров для проведения дальнейших испытаний. 17 персонального мониторинга требует небольшой системы, которая поставляется с платой меньшее количество образцов.

Существует много подходов для определения воздействия на здоровье от воздействия аэрозоля. Али модель позволяет для аэрозолей под управлением непосредственно к клеткам через воздух как реального воздействием сценарий, но это более экономически эффективным и меньше времени, интенсивные чем в vivo исследований во время имитируя воздуха жидкость барьеры, такие как глаза, кожи и легких. Клетки легких, выращенных на Али имеют способность генерировать поляризованные барьерного слоя,18,19 , которая производит физиологические черты, которые напоминают в естественных условиях легких эпителия, включая производство слизи и ПАВ в конкретных бронхов или альвеолярного клеточных линий, реснички, избиение,19 плотные соединения,19,20 и ячейки поляризации. 18 изменения, такие, как они могут повлиять на клеточный ответ, измеряется в исследованиях токсичности. 21 Кроме того, Али в vitro модели результаты часто более чувствительны, чем клетки подвергаются через подвеска модели22 и состоянии модель острой в vivo ингаляционной токсичности. 23 , 24 Итак, Али воздействия системы, которая способна выполнять измерения в зоне дыхания является естественный следующий шаг.

Предоставляя клетки аэрозоля непосредственно у источника выбросов, исследование эффектов всех газов, полулетучих соединений и частиц, участвующих в смеси происходит. Когда смесь собираются в фильтра, газов и летучих соединений не захватываются и смеси в целом не могут быть расследованы. Кроме того растворение частиц в порошок или жидкое подвеска может привести к агрегации или частицы жидкости взаимодействиями, такими как растворение, в жидкой суспензии. 25 , 26 когда аэрозольные частицы добавляются к жидкости, есть высокий потенциал для агломерации,25,27 формирования белков Корона,28 или взаимодействия с соединениями в жидкости, которая может повлиять на осаждения и влияние биологической реакции. 29 , 30

Воздействия на Али основана на трех основных аэрозоля профили, Облако усадки, параллельных потока и потока перпендикулярно. Облако, оседая, используется интерфейс воздействия воздуха-жидкость по клеток (Алиса),4 является пакетной системы, где частицы депозит с помощью гравитационного и диффузионных урегулирования как аэрозоль рассматривается как единое целое. Параллельных потока, используется электростатический аэрозоля в vitro воздействия системы (КАРНИЗ)5 и многообразия экспозиции камеры (MEC) II,6 позволяет для осаждения путем добавления броуновского движения через профиля потока. Перпендикулярно потока, используется microsprayer,7 Nano аэрозольной камеры для In-Vitro токсичности (NACIVT),11 и коммерческих Али систем8,9,10,12, добавляет сдавление из частицы в регионе осаждения. Многие из этих систем экспозиции, большие и громоздкие, требуя избыточных систем для аэрозольных предварительного кондиционирования, насосы для потока, или даже нагрева камеры для инкубации клеток. Этот большой размер уменьшается переносимости системы. Вместо выборки непосредственно у источника выбросов, эти системы часто имеют образцы принесли в лаборатории или модели аэрозолей, созданный для анализа. Сложность выбросов аэрозолей могут быть потеряны в переводе из поля в лабораторию. PIVEC меньше, чем нынешние системы, с внешней поверхности площадью приблизительно 460 см2 и весом всего 60 грамм, с тепловлажностной управления включены в систему, позволяя для высоко портативного устройства. Уменьшение размера и веса позволяют системе изношены или принятых на источник облучения, позволяя прямой выборки.

Большой размер текущего воздействия систем также снижает способность выполнять выборки для изучения пространственных градиентов концентраций. Эта резолюция является ключевым при определении токсикологическое воздействие многих потенциальных экологических и профессиональных рисков например автомобильных выхлопных твердых частиц или на рабочем месте деятельности где аэрозолизации происходит. Сразу же после выбросов, там становится пространственной дисперсии в концентрации частиц. Это растет с течением времени, как частицы рассеивают всей атмосферы, и эти эффекты можно изменить на основании условий окружающей среды, таких как температура, давление, ветра и солнца. Частицы могут начать возраст и окисляются также раз выпущенного31,32 и разгон тарифы зависят от рельефа; более высокие концентрации будут найдены в каньоны и туннелей, где замедлился дисперсии эффекты, и более низкой концентрации можно найти там, где есть большой площади для распыления. 33 эти изменения ставок дисперсии могут иметь существенное воздействие на здоровье человека и можно видеть при сравнении количество астматических взрослых, живущих в городских и в сельских условиях. 34 в то время как многие воздействия системы обеспечивают сразу несколько образцов, несколько систем необходимы с обилием крупных оборудования для выполнения пространственного разрешения.

Собрав в лабораторию к полю, время анализа может быть уменьшена с помощью клеточных как датчик. После известных биологических механизмов и конечные точки могут помочь в определении состава аэрозолей и размер. Из-за медленного оформления методов, включая мукоцилиарный клиренс, фагоцитоз и транслокации эти частицы часто взаимодействуют с клеток примерно дней недели3 генерации оксидативного стресса, воспаления и даже смерти клетки. Эти биологические конечные точки могут быть отправной точкой для пути неблагоприятного исхода для сердечно-сосудистых заболеваний или хроническая обструктивная болезнь легких. Кроме того Wiemenn et al. выполнена массив в vitro анализов для сравнения с литературными значениями для краткосрочной перспективе в vivo ингаляционной токсичности. 35 В естественных условиях реакция была предсказана с двумя из четырех положительные результаты тестирования цитотоксичность через лактатдегидрогеназа релиз, оксидативный стресс от глутатион сокращения и перекись водорода формирования и выпуска и воспаление потенциал фактор некроза опухоли альфа-ген. Из десяти наноразмерные оксиды металлов испытания, 6 протестированы как активный (оксид титана, оксид цинка и четыре разных церия оксид) с помощью облучения в пробирке с подтверждением в естественных условиях

С целью изучения воздействия аэрозолей в профессиональной обстановке, наша лаборатория разработала PIVEC для воздействия на местах. Кроме того PIVEC можно носить для личного отбора проб для мониторинга и расследования вдыхания как Кассетный фильтр 37 мм36 или несколько систем может использоваться для достижения пространственное разрешение в пределах данной области. В этом протоколе обсуждается характеристика и использование PIVEC. После облучения биологические эффекты наблюдаются через цитотоксичность анализов.

Protocol

Операторы должны носить средства индивидуальной защиты (например, лаборатории пальто, перчатки, очки) при выполнении шагов 1, 2, 3, 5 и 6. 1. Подготовка материалов Подготовьте материалы для системы Ассамблеи и воздействия для обеспечения повторяемости. Уб…

Representative Results

Труда в vitro токсикологии включает в себя поддержание клеточной жизнеспособности при выполнении воздействия аэрозолей. PIVEC системы показано на Рисунок 2, включая температуру и контроль влажности и носить PIVEC. Температура поддерживалась с помощью б?…

Discussion

Фильтр кассеты обеспечивают простой и недорогой метод сбора аэрозолей в зоне дыхания; Однако образцы аэрозоля, извлеченные из фильтров не представляют всю аэрозоля (т.е. газов, летучих веществ и твердых частиц) и соответственно ограничить оценку соответствующих биологических эффектов…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Борис Соломонов и магазин машина инноваций Содружества Вирджиния за помощь с быстрое прототипирование устройства. Авторы хотели бы также поблагодарить Cristian Ромеро-Фуэнтес Левинский группы, д-р Виталий Аврутин, д-р Дмитрий Пестов и Вирджиния Содружества наноматериалов основных характеристик объекта за их помощь с гранулометрического состава. Эта работа была поддержана запуска средства, предоставленные для доктора Левинский Инженерный колледж Университета Содружества Вирджинии.

Materials

Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

Referencias

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. . Aerosol Science for Industrial Hygienists. , (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. . . Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter–biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells – a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. . NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O’Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air – liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).
check_url/es/58916?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

View Video