Summary

Eine neue Portable In-vitro- Exposition Kassette für Aerosol-Sampling

Published: February 22, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um tragbare zellulären Aerosol Belichtungen durchführen und zelluläre Reaktion zu messen. Die Methode verwendet Zellen, an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, imitiert in Vivo Physiologie gewachsen. Zelluläre Reaktion auf Kupfer Nanopartikel Aerosole wurde als oxidativer Stress durch reaktiven Sauerstoff-Spezies-Generation und Zytotoxizität als Laktat-Dehydrogenase Freisetzung beobachtet.

Abstract

Dieses Protokoll stellt ein neues in-vitro- Belichtung System, getragen wird, einschließlich seiner Charakterisierung und Leistung. Air-Liquid-Schnittstelle (ALI) in-vitro- Belichtung Systeme sind oft groß und sperrig, Transport zum Feld und Betrieb an der Quelle der Emission oder innerhalb der Atemzone erschwert. Durch Miniaturisierung dieser Systeme kann im Labor gebracht werden, zum Feld, Beschleunigung Verarbeitungszeit und Bereitstellung einer angebrachter Belichtungsmethode, die nicht das Aerosol vor der Kontaktaufnahme mit den Zellen verändert wird. Die Portable In-vitro- Exposition Kassette (PIVEC) passt eine 37-mm-Filterkassette für in-vitro- Toxizitätstests außerhalb der traditionellen Labor ermöglichen. Die PIVEC war geprägt mit drei Größen der Kupfernanopartikel Ablagerung Effizienz basierend auf gravimetrische bestimmen und Partikelanalyse Nummer Konzentration. Anfängliche Zytotoxizität Experimente wurden mit exponierten Lungenzellen zu bestimmen, die Fähigkeit des Systems, Partikel zu hinterlegen, unter Beibehaltung der Zellviabilität durchgeführt. Die PIVEC bietet eine ähnliche oder höhere Ablagerung Effizienz im Vergleich zur verfügbaren senkrecht fließen in-vitro- Belichtungsgeräte. Trotz der geringeren Probendurchsatz verleiht der Kleinheit einige Vorteile der aktuellen in-vitro- ALI Belichtung Systeme. Dazu gehören die Fähigkeit, persönliche Überwachung getragen werden, Mobilität aus dem Labor, um die Quelle der Emissionen und die Option zum Einrichten mehrerer Systeme für räumliche Auflösung und gleichzeitig einen niedrigeren Benutzer Kosten. Die PIVEC ist ein System, das Sammeln von Aerosolen im Feld und in die Atemzone auf einem Luft-Schnittstelle, in-vitro- Modell.

Introduction

Persönlichen Probenahme mittels in-vitro- Techniken könnten umfassende Informationen über die biologischen Wirkungen der Aerosole am Arbeitsplatz. 1 Forderungen an Verunreinigungen in der Luft enthalten Forderungen gegenüber dem chemischen Stoff selbst, um die gesammelten Luftproben getauchten Bedingungen wo das Gas die Zellsuspension intermittierende Exposition mit einem Gerät wie ein Rocker oder direkte eingeführt ist Forderungen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit (ALI). 2 viele dieser Techniken erfolgt mit Zellen in Suspension oder die Entnahme von Proben vor der Belichtung, von die jede die toxikologische Studie aufgrund von möglichen Änderungen in das Aerosol beeinflussen kann. 3 um diese Änderungen zu vermeiden, kann das Labor zum Feld mit mehreren in-vitro- ALI Kultur Belichtung Systeme gebracht werden, die in der Literatur,4,5,6,7verwendet werden, 8,9,10,11,12,13 aber nur wenige sind im Handel erhältlich. 8 , 9 , 12 dieser Systeme sind oft sperrig, vor allem wenn Sie Instrumente zur Regulierung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit von der zellulären Umgebung und der Durchflussmenge des Aerosols Probe. Mithilfe der PIVEC können Aerosol Belichtungen außerhalb einer traditionellen Testumgebung oder innerhalb der Atemzone durchgeführt werden, während der Inhalation Bedingungen imitiert.

Die Bestimmung des Aerosol Deposition in Vitro ist wichtig, die Untersuchung der Auswirkungen auf die Gesundheit durch Inhalation. Der Atemzone ist der Bereich innerhalb 30 cm vom Mund und Nase,14 entscheidend für das Verständnis der Exposition mit Nanopartikeln und für die Anbindung an die biologischen Effekte in der Lunge. 2 oft die Ablagerung auf Zellen einen Wirkungsgrad von Ablagerung, die Partikel abgeschieden auf und von den Zellen geteilt durch die Partikel in die System-6,15 oder Masse anhand der gleichen Mengen verabreicht aufgenommen bezeichnet. 4 , 16 die aktuellen Methoden zur Messung von Aerosolen in die Atemzone sind Filter basieren, Erfassung von Teilchen innerhalb einer bestimmten Abtastzeitabschnitts und Filter verwenden, um weitere Tests durchzuführen. 17 persönliche Überwachung erfordert ein kleines System, das mit dem Kompromiss von weniger Proben kommt.

Es gibt viele Ansätze, die die gesundheitlichen Auswirkungen von Aussetzung zu ein Aerosol zu bestimmen. Das ALI-Modell ermöglicht das Aerosol direkt auf die Zellen durch die Luft wie ein echter Expositionsszenario verabreicht werden aber es ist kostengünstiger und weniger zeitintensiv als in Vivo Studien während imitiert die Luft-Flüssigkeit Barrieren wie die Augen, Haut und Lunge. Gewachsen auf der ALI Lungenzellen haben die Fähigkeit, erzeugen eine polarisierte Sperrschicht,18,19 die physiologischen Eigenschaften, die das in Vivo Lunge Epithel produziert, einschließlich Schleim und Tensid Produktion in bestimmten ähneln bronchiale oder alveoläre Zelllinien, Zilien schlagen,19 tight Junctions,19,20 und Zelle Polarisation. 18 Änderungen wie diese die zelluläre Reaktion gemessen in Toxizitätsstudien beeinflussen können. 21 darüber hinaus ergibt sich ALI in-vitro- Modell sind oft empfindlicher als Zellen über Aussetzung Modelle22 verfügbar gemacht und sind in der Lage zum Modell akuten in Vivo Inhalation Toxizität. 23 , 24 daher ist ein ALI Belichtungssystem, die Durchführung von Messungen innerhalb der Atemzone kann ein logischer nächster Schritt.

Indem man die Zellen Aerosol direkt an der Quelle der Emission, tritt Untersuchung der Auswirkungen aller Gase, semi-flüchtige Verbindungen und Partikel in die Mischung beteiligt. Wenn die Mischung auf einem Filter gesammelt, die Gase und flüchtige Verbindungen werden nicht erfasst und die ganze Mischung kann nicht untersucht werden. Darüber hinaus kann die Rekonstitution der Partikel in ein Pulver oder eine flüssige Suspension zu Aggregation oder Partikel-Fluid Interaktionen, wie Auflösung, in der liquid Suspension führen. 25 , 26 wenn Aerosol-Partikel in der Flüssigkeit hinzugefügt werden, gibt es ein höheres Potenzial für die Agglomeration,25,27 Bildung eines Proteins Corona,28 oder Interaktion mit Verbindungen in die Flüssigkeit, die Ablagerung beeinflussen können und beeinflussen Sie die biologische Reaktion. 29 , 30

Exposition in der ALI basiert auf drei wesentlichen Aerosol Profile, Wolke Beilegung, parallel Fluss und senkrecht Fluss. Cloud, Abrechnung, verwendet durch Air-Liquid Interface Zelle Exposition (ALICE),4 ist ein Batchsystem einzahlen wo Partikel durch Schwerkraft und Diffusionsprozess absetzen, da das Aerosol als eine Einheit behandelt wird. Parallele Strömung, verwendet durch die elektrostatische Aerosol in-vitro- Belichtung System (Traufe)5 und Multikultur Exposition Kammer (MEC) II,6 ermöglicht die Abscheidung durch die Zugabe von Brownsche Bewegung durch das Strömungsprofil. Senkrecht-Flow, verwendet durch eine Mikrosprayer,7 Nano Nebelkammer für In-vitro-Toxizität (NACIVT),11 und kommerziellen ALI Systeme8,9,10,12, fügt die Impaktion von Partikel in der Ablagerung-Region. Viele dieser Belichtung Systeme sind groß und sperrig, dass überschüssige Systeme für Aerosol Vorklimatisierung, Pumpen für die Strömung, oder sogar Heizung Kammern für die Inkubation der Zellen. Dieser große Größe verringert die Portabilität des Systems. Anstelle von Probenahme direkt an der Quelle der Emission haben diese Systeme oft Proben ins Labor oder Modell Aerosole erzeugt für die Analyse. Die Komplexität des emittierten Aerosols kann in der Übersetzung aus dem Bereich ins Labor verloren. Die PIVEC ist kleiner als die aktuelle Systeme mit einer Außenfläche von ca. 460 cm2 und wiegt nur 60 Gramm, mit thermischen und Feuchtigkeitskontrolle in das System ermöglicht ein sehr portables Gerät integriert. Die geringere Größe und Gewicht lassen das System getroffen, um die Quelle der Exposition, direkte Probenahme bei schönem oder getragen werden.

Die Größe der aktuellen Belichtung Systeme verringert auch die Fähigkeit, Probenahme zur Untersuchung der räumlichen Gradienten in Konzentrationen führen. Diese Auflösung ist Schlüssel bei der Bestimmung von toxikologischer Wirkungen vieler Potenzial Umwelt-und betriebliche Unfallgefährdungen wie Feinstaub Angelegenheit oder am Arbeitsplatz Tätigkeiten Fahrzeugverkehr Auspuff bei Aerosolization auftritt. Sofort nach Emission, dort wird eine räumliche Abweichung in Partikelkonzentration. Dies wächst mit der Zeit wie die Partikel in der Atmosphäre zu verteilen und diese Effekte können je nach den Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Druck, Wind und Sonne. Partikel können beginnen zu altern und oxidieren auch einmal abgegebene31,32 und Zerstreuung Preise von der Topographie betroffen sind; höhere Konzentrationen finden Sie in den Schluchten und Tunnel, wo Dispersionseffekte werden verlangsamt, und niedrigere Konzentrationen finden wo gibt es eine große Fläche für Dispersion. 33 diese Steuersatzänderungen Streuung können erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben und können gesehen werden, wenn die Zahl der Asthmatiker Erwachsenen Leben in städtischen und in ländlichen Gebieten zu vergleichen. 34 während viele Belichtung Systeme mehrere Proben gleichzeitig zur Verfügung stellen, sind mehrere Systeme erforderlich mit einer Fülle von Großgeräten räumlichen Auflösung durchführen.

Indem das Labor auf das Feld, kann die Zeit der Analyse mithilfe der ganzen Zelle als Sensor verringert werden. Nach bekannten biologischen Mechanismen und Endpunkte kann bei der Ermittlung der Aerosol-Zusammensetzung und Größe helfen. Aufgrund der langsamen Clearance-Methoden, einschließlich Mucociliary Clearance, Phagozytose und Translokation sind diese Partikel oft Interaktion mit Zellen ca. Tage bis Wochen3 Erzeugung von oxidativen Stress, Entzündungen und sogar Zelltod. Diese biologische Endpunkte können Ausgangspunkte für negativen Ausgang Wege zur kardiovaskulären Erkrankungen oder chronisch obstruktiver Lungenerkrankung sein. Wiemenn Et Al. durchgeführt darüber hinaus eine Reihe von in-vitro- Tests mit Literatur Werte für kurzfristige in Vivo Inhalation Toxizität zu vergleichen. 35 In Vivo Antwort wurde mit zwei der vier positive Ergebnisse aus Tests Zytotoxizität über Laktat-Dehydrogenase Release, oxidativen Stress von Glutathion Reduktion und Wasserstoffperoxid Bildung und Freisetzung und Entzündung von potenziellen vorhergesagt. Das Tumor-Nekrose-Faktor alpha gen. Aus zehn Schichtmaterialien Metalloxide getestet, sechs getestet als aktiv (Titandioxid, Zinkoxid und vier verschiedenen Cerium-Oxid) mit Aufnahmen in Vitro mit Bestätigung in Vivo

Zur Untersuchung der Auswirkungen von Aerosolen in einem beruflichen Umfeld entwickelt unser Labor PIVEC für Aufnahmen im Bereich. Darüber hinaus die PIVEC kann für persönliche Probenahme zu überwachen und untersuchen Inhalationsexposition wie die 37-mm-Filter Kassette36 getragen werden oder mehrere Systeme können verwendet werden, um räumliche Auflösung in einem bestimmten Gebiet zu erreichen. In diesem Protokoll wird die Charakterisierung und Einsatz von der PIVEC diskutiert. Nach der Belichtung werden die biologischen Effekte durch Zytotoxizität Assays beobachtet.

Protocol

Betreiber tragen persönlichen Schutzausrüstung (z.B. Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) beim Ausführen der Schritte 1, 2, 3, 5 und 6. 1. Vorbereitung der Materialien Bereiten Sie Materialien für System-Montage und Belichtung Wiederholbarkeit zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, Einsatz neuer oder 70 % igem Ethanol gereinigt ¼” Innendurchmesser leitfähigen Schlauch und ¼” Außendurchmesser Anschlüsse für den Systemaufbau. Shop Testmater…

Representative Results

Am Arbeitsplatz in-vitro- Toxikologie umfasst Erhaltung zelluläre Lebensfähigkeit während der Durchführung von Aerosol-Exposition. Das PIVEC-System ist in Abbildung 2, unter anderem die Temperatur und feuchte-Steuerung und abgenutzte PIVEC dargestellt. Die Temperatur wurde über eine batteriebetriebene Ohmsche Heizung gepflegt und das Aerosol befeuchtet mit erhöht natürliche Befeuchtung durch eine poröse, benetzte Rohr. In einer kontrollierten…

Discussion

Filterkassetten bieten eine einfache, kostengünstige Methode des Sammelns Aerosole in die Atemzone; jedoch Aerosol Proben extrahiert vom Filter nicht repräsentieren das gesamte Aerosol (d.h. Gase, flüchtigen Stoffen und Partikeln) und daher die Bewertung der damit verbundenen biologischen Wirkungen zu begrenzen. Mit den ersten Entwurf der 37-mm-Filter-Kassette, die PIVEC soll Portabilität zu erhalten und die in Vivo Abscheidung von Partikeln aus Inhalation zu imitieren. Die PIVEC ist deutlich kleiner als die…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Boris Solomonov und der Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop für Hilfe mit rapid Prototyping Gerät danken. Die Autoren möchten auch Danke Cristian Romero-Fuentes des Arbeitskreises Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov und die Virginia Commonwealth Nanomaterialien Kern Charakterisierung Anlage für ihre Hilfe mit Partikelcharakterisierung. Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds Dr. Lewinski von der College of Engineering an der Virginia Commonwealth University zur Verfügung gestellten unterstützt.

Materials

Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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