Summary

Une nouveau Portable In Vitro exposition Cassette pour l’échantillonnage des aérosols

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expositions portable cellulaire aérosol et mesurer la réponse cellulaire. La méthode utilise des cellules, cultivées à l’interface air-liquide, imitant en vivo physiologie. Réponse cellulaire aux aérosols de nanoparticules de cuivre a été observée dans le stress oxydatif grâce à la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la cytotoxicité dans le communiqué de la lactate déshydrogénase.

Abstract

Ce protocole introduit un nouveau in vitro l’exposition système, pouvant être portés, y compris de sa caractérisation et performance. Systèmes de l’interface air-liquide (ALI) in vitro exposition sont souvent grands et encombrants, rendant le transport au champ et au fonctionnement à la source de l’émission ou la zone de respiration difficile. Grâce à la miniaturisation de ces systèmes, le laboratoire peut être amené au champ, accélérer les temps de traitement et en fournissant une méthode plus appropriée d’exposition qui n’altère pas l’aérosol avant de communiquer avec les cellules. Le Portable In vitro l’exposition Cassette (HONZÁK) s’adapte une cassette de filtre 37 mm pour permettre in vitro des essais de toxicité à l’extérieur du laboratoire traditionnel. Le HONZÁK a été caractérisée à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre afin de déterminer l’efficacité de dépôts basée sur gravimétrique et analyse de concentration nombre de particules. Cytotoxicité initiale expériences ont été réalisées avec des cellules pulmonaires exposées afin de déterminer la capacité du système de dépôt des particules tout en préservant la viabilité des cellules. Le HONZÁK offre une efficacité similaire ou une augmentation des dépôts lors de la comparaison d’appareils disponibles écoulement perpendiculaire in vitro d’exposition. Malgré le débit d’échantillon inférieur, la petite taille donne certains avantages au courant in vitro ALI systèmes d’exposition. Il s’agit de la capacité à être portés pour la surveillance personnelle, la mobilité du laboratoire à la source d’émission et l’option de mettre en place plusieurs systèmes de résolution spatiale tout en conservant un utilisateur plus faible coûtent. Le HONZÁK est un système capable de recueillir des aérosols sur le terrain et au sein de la zone de respiration sur un modèle air-relié, in vitro .

Introduction

Échantillonnage individuel en utilisant des techniques in vitro pourrait fournir des informations complètes concernant les effets biologiques des aérosols sur le lieu de travail. 1 exposition à des contaminants dans l’air inclure l’exposition au produit chimique lui-même, pour les échantillons d’air recueillis, dans des conditions submergées, où le gaz est introduit à la suspension cellulaire, exposition intermittente à l’aide d’un périphérique comme un rocker, ou direct expositions à l’interface air-liquide (ALI). 2 plusieurs de ces techniques sont effectuées avec des cellules cultivées en suspension ou de la collecte d’échantillons avant l’exposition, dont chacun peut affecter l’étude toxicologique à cause de changements potentiels dans l’aérosol. 3 pour éviter ces changements, le laboratoire peut être amené à ce champ en utilisant plusieurs in vitro systèmes d’exposition de la culture ALI qui sont utilisés dans la littérature,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 cependant, peu sont disponibles dans le commerce. 8 , 9 , 12 ces systèmes sont souvent volumineux, surtout quand les instruments pour réguler la température et l’humidité de l’environnement cellulaire et du débit de l’aérosol d’échantillon. En utilisant le HONZÁK, expositions de l’aérosol peuvent être réalisées en dehors d’un paramètre de laboratoire traditionnel ou la zone de respiration en imitant les conditions de l’inhalation.

La détermination de l’aerosol deposition in vitro est importante pour l’étude des effets de santé en raison de l’inhalation. La zone de respiration, la zone de moins de 30 cm de la bouche et le nez,14 est cruciale pour comprendre l’exposition aux nanoparticules et un lien vers les effets biologiques dans les poumons. 2 souvent, les dépôt sur les cellules est défini comme un rendement de dépôts, les particules déposées sur et absorbé par les cellules divisés par les particules administrées au système6,15 , ou sur une base massive des mêmes montants. 4 , 16 les méthodes actuelles pour mesurer les aérosols présents dans la zone de respiration sont filtre basé, capturant les particules sur une période donnée d’échantillonnage en utilisant les filtres de mener des essais supplémentaires. 17 surveillance personnelle nécessite un petit système qui vient avec le compromis de moins d’échantillons.

Il existe de nombreuses approches pour déterminer les effets sur la santé d’une exposition à un aérosol. Le modèle ALI permet l’aérosol à administrer directement aux cellules par l’intermédiaire de l’air comme dans un scénario d’exposition réelle, mais il est plus rentable et moins intensif de temps qu’in vivo études tout en imitant les barrières d’air liquide tels que les yeux, peau et les poumons. Poumon cellules cultivées à l’ILA ont la capacité de générer une couche barrière polarisée,18,19 , qui produit des caractéristiques physiologiques qui ressemblent à l’épithélium de poumon en vivo , y compris la production de mucus et agent tensio-actif en particulier lignées de cellules bronchiques ou alvéolaire, cils,19 des jonctions serrées,19,20 et cellules de polarisation. 18 changements comme ceux-ci peuvent affecter la réponse cellulaire mesurée dans les études de toxicité. 21 en outre, modèle, ALI in vitro résultats sont souvent plus sensibles que les cellules exposées par suspension modèles22 et sont capables de modèle aiguë in vivo toxicité par inhalation. 23 , 24 c’est pourquoi, un système d’exposition ALI qui est capable d’effectuer des mesures au sein de la zone de respiration est une étape naturelle.

En exposant les cellules à aérosols directement à la source d’émission, étude sur les effets de tous les gaz, les composés semi-volatils et particules impliquées dans le mélange se produit. Lorsque le mélange est recueilli sur un filtre, les gaz et les composés volatils ne sont pas capturés et le mélange entier ne peut pas être l’objet d’une enquête. En outre, reconstitution des particules dans une poudre ou une suspension liquide peut conduire à l’agrégation ou interactions particule-fluide, comme la dissolution, en suspension liquide. 25 , 26 lorsque des particules d’aérosol sont ajoutés au liquide, il y a un potentiel plus élevé d’agglomération, formation27 25,de corona de protéines,28 ou interaction avec des composés dans le liquide, qui peut affecter des dépôts et influencer la réponse biologique. 29 , 30

Exposition à l’ILA repose sur trois profils principaux aérosol, nuage des flux parallèles, décantation et écoulement perpendiculaire. Cloud s’installant, utilisé par exposition de cellule pour l’Interface Air-liquide (ALICE),4 est un système de traitement par lots où déposent des particules par gravitation et diffusion s’installer comme l’aérosol est traité comme une seule unité. Les flux parallèle, utilisée par les aérosols électrostatiques in vitro l’exposition système (gouttières)5 et Multiculture exposition chambre (MEC) II,6 permet pour les dépôts par le biais de l’ajout du mouvement brownien par le profil d’écoulement. Écoulement perpendiculaire, utilisé par un microsprayer,7 Nano aérochambre pour toxicité In Vitro (NACIVT),11 et commercial ALI systèmes8,9,10,12, ajoute l’impaction de particules dans la zone de dépôt. Beaucoup de ces systèmes d’exposition sont grands et encombrants, exigeant des systèmes excédentaires pour aérosol pré conditionnement, pompes pour l’écoulement, ou même de chauffage des chambres pour l’incubation des cellules. Cette grande taille diminue la portabilité du système. Au lieu de prélèvement à la source d’émission, ces systèmes ont souvent apportés à des aérosols de laboratoire ou modèle générés pour l’analyse des échantillons. La complexité de l’aérosol émis peut être perdue dans la traduction sur le terrain au laboratoire. Le HONZÁK est plus petit que les systèmes actuels, avec une surface extérieure d’environ 460 cm2 et ne pesant que 60 grammes, avec contrôle thermique et d’humidité intégré dans le système permettant à un périphérique portable. La diminution de taille et le poids permettent au système d’être porté ou prises à la source d’exposition, permettant le prélèvement direct.

La grande taille des systèmes actuels de l’exposition diminue également la capacité d’effectuer l’échantillonnage pour enquêter sur des gradients spatiaux dans les concentrations. Cette résolution est la clé pour déterminer les effets toxicologiques de nombreux risques pour l’environnement et des risques professionnels tels que les activités de matière ou lieu de travail particules d’échappement véhicules où aérosolisation se produit. Immédiatement après émission, il devient une variance spatiale dans la concentration de particules. Cela se développe avec le temps que les particules se dispersent dans l’atmosphère et ces effets peuvent changer selon les conditions ambiantes, tels que température, pression, vent et soleil. Les particules peuvent commencer à l’âge et oxyder ainsi une fois émis31,32 et taux de dispersion sont affectés par la topographie ; On trouvera des concentrations plus élevées dans les canyons et les tunnels, où les effets de dispersion sont ralenties, et des concentrations plus faibles se trouvent là où il y a une grande surface de dispersion. 33 ces changements dans les taux de dispersion peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et peuvent être vu quand on compare le nombre d’asthmatiques adultes vivant en urbain ou en milieu rural. 34 alors que de nombreux systèmes d’exposition fournissent plusieurs échantillons à la fois, plusieurs systèmes sont nécessaires avec une abondance de gros équipements pour effectuer la résolution spatiale.

En apportant le laboratoire sur le terrain, le temps d’analyse peut être diminué en utilisant la cellule entière comme un capteur. Suite de points de terminaison et les mécanismes biologiques connus peut aider à la détermination de la composition des aérosols et de la taille. En raison de méthodes de dégagement lent, y compris la clairance mucociliaire, phagocytose et translocation, ces particules sont souvent en interaction avec les cellules pour quelque jours à semaines3 génératrices de stress oxydatif, l’inflammation et même la mort des cellules. Ces points de terminaison biologiques peuvent être les points de départ pour les voies d’issue défavorable pour les maladies cardiovasculaires ou les maladies pulmonaires obstructives chroniques. En outre, Wiemenn et coll. réalisé un tableau in vitro tests à comparer avec les valeurs de la littérature à court terme en vivo toxicité par inhalation. 35 In vivo la réponse a été prévue avec deux des quatre résultats positifs des tests de cytotoxicité par communiqué de la lactate déshydrogénase, stress oxydatif, de réduction et peroxyde d’hydrogène la formation de glutathion et libération et inflammation potentielle de le gène de facteur de nécrose tumorale alpha. Hors des oxydes métalliques dix taille nano testés, six testées comme active (oxyde de titane, oxyde de zinc et quatre l’oxyde de cérium différents) à l’aide d’expositions in vitro avec confirmation en vivo

Afin d’étudier les effets des aérosols dans un milieu professionnel, notre laboratoire a développé le HONZÁK pour des expositions dans le domaine. En outre, le HONZÁK peut être porté pendant l’échantillonnage individuel de surveiller et d’enquêter sur l’exposition par inhalation comme le 37 mm filtre cassette36 ou plusieurs systèmes peuvent être utilisés pour obtenir une résolution spatiale dans une zone donnée. Dans ce protocole, la caractérisation et l’utilisation de la HONZÁK est discutée. Après l’exposition, les effets biologiques sont observés à travers des analyses de cytotoxicité.

Protocol

Les opérateurs doivent porter les équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) lorsque les étapes 1, 2, 3, 5 et 6. 1. préparation des matériaux Préparer du matériel pour l’assemblage du système et l’exposition à assurer la répétabilité. Assurez-vous d’utilisation nouvelle ou 70 % éthanol nettoyé ¼” diamètre intérieur conducteur tube et ¼” diamètre extérieur connecteurs pour l’assembly system. Magas…

Representative Results

Professionnelle in vitro de toxicologie comprend le maintien de la viabilité cellulaire tout en effectuant l’exposition aérosol. Le système HONZÁK est montré dans la Figure 2, y compris la température et contrôle de l’humidité et la HONZÁK usé. La température a été maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage résistif alimenté par batterie et l’aérosol humidifié à l’aide d’augmenté humidification naturelle à traver…

Discussion

Cassettes de filtre fournissent une méthode simple et peu coûteuse de recueillir des aérosols dans la zone de respiration ; Cependant, extraits des filtres des échantillons d’aérosols ne pas représenter l’aérosol entier (gaz, les substances volatiles et particules) et par conséquent limiter l’évaluation des effets biologiques associés. À l’aide de la conception initiale de la cassette de filtre 37 mm, le HONZÁK est conçu pour maintenir la portabilité et imiter la déposition en vivo de par…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Boris Solomonov et l’atelier d’usinage Virginia Commonwealth Innovation pour aider avec le prototypage rapide de l’appareil. Les auteurs aimeraient également remercier Cristian Romero-Fuentes du groupe Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov et la Virginia Commonwealth nanomatériaux Core caractérisation Facility pour leur aide avec la caractérisation des particules. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage fournis au Dr. Lewinski par la faculté d’ingénierie à la Virginia Commonwealth University.

Materials

Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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Citar este artículo
Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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