Summary

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Published: November 11, 2018
doi:

Summary

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Abstract

Neurale Stammzellen (NSCs) multipotent sind und kann die drei wichtigsten Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen. In-vitro- Kultur und den Ausbau der NSCs bieten eine geeignete Quelle von Zellen für Neurologen, die Funktion von Neuronen zu studieren und Gliazellen zusammen mit ihren Interaktionen. Es gibt verschiedene gemeldeten Techniken für die Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Säugetier-Gehirne. Während der mikrochirurgischen Operation, NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS zu isolieren ist es sehr wichtig, den Schaden zu reduzieren, die Gehirnzellen, das höchste Verhältnis von Live- und erweiterbare Stammzellen zu erhalten. Eine mögliche Technik zum Stressabbau während Isolierung dieser Zellen aus dem Gehirn der Maus-Embryo ist die Reduzierung von OP-Dauer. Hier zeigen wir eine entwickelte Technik für schnelle Isolierung dieser Zellen aus der E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz. Chirurgische Eingriffe sind Ernte E13 -Maus-Embryonen aus der Gebärmutter, schneiden die vordere Fontanelle des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, extrahieren das Gehirn aus dem Schädel, Mikrodissektion von isolierten Gehirn ganglionic Eminenz zu ernten, Dissoziation des geernteten Gewebes im NSC Medium um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewinnen und schließlich Beschichtung Zellen in Suspensionskultur, Neurosphären zu generieren.

Introduction

Neurale Stammzellen (NSCs) befinden sich in verschiedenen Regionen des Gehirns Erwachsener und Embryo und sie haben eine Tendenz, verschiedene Arten von Neuronen und Gliazelle1zu generieren. Die subventricular Zonen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren2 und ganglionic Eminenz im Embryo Gehirn sind NSC reichen Regionen3. In das sich entwickelnde Gehirn liefert die ganglionic Eminenz die meisten kortikale Interneurone und insbesondere GABAergen Interneuronen3. Es gibt auch weniger invasiven Methoden zur Erzeugung von neuronalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen (WSR) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die Senkung der Nachfrage nach Tier verwenden. Trotz der Tatsache, dass die Erzeugung von NSCs aus WSR oder iPSCs möglich4,5ist hat es einige vor- und Nachteile im Vergleich zur Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Gehirn6,7, 8. Die Protokolle zur Induktion der Differenzierung der WSR und iPSCs gegenüber neuronalen Phänotypen sind immer Zeit- und verbrauchen und die Rate der Erfolg (70-80 % Nestin positive Zellen)5 sind niedriger im Vergleich mit direkten Isolierung der NSCs aus dem tierischen Gehirn ( mehr als 99 % Nestin positive Zellen)9. Darüber hinaus verlieren die Stammzellen ihre genetische Stabilität und Differenzierung Tendenz nach mehreren Passagen10,11. Obwohl es andere neue Berichte über die direkte Umwandlung von Körperzellen in NSCs gibt, diese Zellen sind gentechnisch verändert und sind nicht leicht zugänglich in jedem Labor-12. Daher gibt es noch eine große Nachfrage für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus dem tierischen Gehirn; Es ist möglich, die Menge an tierischen Verbrauch zu reduzieren, durch die Verbesserung der Operationstechniken. Durch Reduzierung der OP-Dauer und die Techniken zu verbessern, ist es möglich, halten Zellen weg von Schäden und die höchste Rate an NSCs von jedem Tier zu erhalten.

Hier stellen wir eine vereinfachte und reproduzierbare Technik zur Isolierung von neuronalen Stammzellen von Embryos Gehirn der Maus E13 .

Protocol

Alle Operationen und Prozeduren auf Tier stimmten mit der Tierethik-Ausschuss des Instituts Royan, Teheran, Iran. 1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Wasch-Puffer (HEPES-MEM), Zellkulturmedien und Kultur Zellplatten Chirurgische Instrumente (Schere, Skalpell Klinge Griff und Zange) durch Autoklavieren sie basierend auf den routinemäßigen Sterilisation Leitlinien zu sterilisieren. Bereiten Sie eine angemessene Menge HEPES-MEM-Puffer (etwa 100 mL ist ausreichend…

Representative Results

Micro-Dissektion, Zelle Isolation und Kultur Neurosphäre. Hier präsentierten wir eine schnelle und effiziente Methode zur Maus E13 Gehirn Mikrochirurgie und Isolierung von neuralen Stammzellen. Dieser Artikel zeigt, dass es möglich ist, das ganze Gehirn von einem E13 Maus Embryo Schädel durch einen feinen Bruch im vorderen Fontanelle zu entfernen. Mit dieser Methode wird das Gehirn erträgt weniger Schaden und es ist möglich, Zellen aus verschie…

Discussion

Mit einer geeigneten Bezugsquelle von neuralen Stammzellen ist sehr wichtig für die Neurowissenschaftler. Neurale Stammzellen könnten aus verschiedenen Bereichen des Gehirns Embryo geerntet werden und sie können bestimmte Typen von Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt mehrere Methoden für die Induktion der Differenzierung der neuralen Stammzellen induzieren sie Reifen Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt zahlreiche Berichte, wonach unter bestimmten Kulturbedingungen und trophischen Faktor Regiment…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Royan-Institut unterstützt.

Materials

15 mL tubes Falcon 352097
50 mL tubes Falcon 352235
Adson Forceps, 12 cm, Straight WPI 14226
B27 Gibco 17504-44
bFGF Sigma F0291
bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
dish 10cm  Falcon 353003
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight WPI 15908
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight WPI 500342
EGF Sigma E9644
Ethanol Merck 100983 
Glutamate Sigma  G3291
Glutamax Gibco 35050061
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody Sigma AP307F
goat serum Sigma G9023
Heparin   Sigma h3149
HEPES Sigma 83264
HEPES Sigma 90909C
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle  SUPA medical A1SNL127
laminin sigma    L2020
MEM Sigma M2279
N2 supplement Gibco 17502048
NB medium Gibco 21103-31
Non-essential amino acid (NEAA) Gibco 11140050
PBS without Ca and Mg Gibco 20012050
Penicilin/ Streptomycin Gibco 5140122
Poly-L-ornithine Sigma  P4957
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody Sigma T2200
rabbit anti mouse GFAP antibody Sigma G4546
rabbit anti mouse Nestin antibody Sigma N5413
Scalpel Handle #3 WPI 500236
Scissors curve WPI 14396
Scissors sharp straight WPI 14192
Soybean trypsin inhibitor Roche 10109886001 
Tissue culture flasks, T25 BD 353014
Tissue culture flasks, T75 BD 353024
Tween 20 Sigma P1379
Vannas Scissors,  8 cm, Straight  WPI 14003
β-mercaptoethanol Sigma M6250

Referencias

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Citar este artículo
Homayouni Moghadam, F., Sadeghi-Zadeh, M., Alizadeh-Shoorjestan, B., Dehghani-Varnamkhasti, R., Narimani, S., Darabi, L., Kiani Esfahani, A., Nasr Esfahani, M. H. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58874, doi:10.3791/58874 (2018).

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