Эта статья представляет метод для изучения никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChRs) в срезы мозга мыши, никотин uncaging. При сочетании с одновременным патч зажим записи и 2-Фотон лазерной сканирующей микроскопии, никотин uncaging соединяет никотиновых рецепторов функция с клеточной морфологии, обеспечивая более глубокое понимание холинергических нейробиологии.
Ацетилхолин (ACh) действует через рецепторов модулируют разнообразные нейронные процессы, но она была сложной связать функции рецепторов ACh с субцеллюлярные расположение внутри клетки, где эта функция осуществляется. Для изучения субцеллюлярные расположение никотиновых рецепторов ACh (nAChRs) в родной мозговой ткани, оптический метод был разработан для точного выхода никотина в отдельных местах вблизи нейрональных мембран во время электрофизиологических записи. Патч зажат нейронов в мозге, ломтики заполнены с красителя визуализировать их морфология во время 2-Фотон лазерная сканирующая микроскопия, и никотин uncaging выполняется с вспышка, сосредоточив внимание луч лазера 405 нм у одного или нескольких клеточных мембран. Сотовый текущего отклонения измеряются, и трехмерные (3D) изображения с высоким разрешением записанные нейрона производится чтобы примирение nAChR ответы с клеточной морфологии. Этот метод позволяет для детального анализа функционального распределения nAChR в сложных ткани препаратов, перспективных для расширения понимания холинергических синапсах.
Холинергических сигнализации модулирует многочисленные процессы мозга, включая внимания управления, волевые движения и вознаграждение1,2. Препаратов, улучшающих передачи ацетилхолина (ACh) используются для лечения когнитивных нарушений, связанных с болезнью Альцгеймера, подразумевая важную роль для холинергических систем в познании3. Улучшение понимания холинергических рецепторов и схем в государствах, здорового и больного может привести к более терапевтические подходы для нескольких неврологических заболеваний/расстройств.
Никотиновых рецепторов ACh (nAChRs) — семейство лиганд закрытый ионных каналов, которые поток катионы в ответ ACh эндогенных или экзогенных никотина от табачных изделий. Учитывая тот факт, что они были среди первых нейромедиатора рецепторов к быть описано4, nAChR фармакологии и расположение в мышечных волокон понятных для мышц типа рецепторов. Напротив сравнительно мало что известно о фармакологии и внутриклеточных распределение родной nAChRs в мозге. Этот пробел в знаниях выступил недавно развивающихся роман химической зонд, который позволяет пространственно ограниченных и быстрой активации nAChRs в ткани мозга во время сотовой изображений и электрофизиологические записи5. Здесь описаны ключевые методологические этапы такой подход, с учетом общей цели укрепления способности для подключения nAChR функция с нейронные структуры.
Photoactivatable никотина (ПА-Nic; химическое название: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-амино] кумарина-4-ил] метил никотин) могут быть photolyzed с ~ 405 нм лазер вспышки эффективно выпустить никотина5,6. До uncaging, ПА-Nic стабилен в растворе и экспонаты не неприятных фармакологических или фотохимического особенности5. После фотолиз выпущенный никотина предсказуемо активирует nAChRs и uncaging побочные продукты являются фармакологически инертных5. Непрерывном лазер используется в качестве источника света фотолиза с выходной мощностью > 1 МВт измеряется на образце. При локализации, целенаправленных фото стимуляции сочетается с возможность обнаружения клеточных мембран с 2-Фотон лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM), и два ключевых преимущества этого подхода будут полностью реализованы: скорость фотолиз и пространственной точностью.
Во многих отношениях фотолиз PA-Nic превосходит другие методы доставки nAChR лиганды рецепторов в пределах срезы мозга. Такие подходы включают ванна приложения7 и локальных доставки через фугу дозатор8. Первый подход, как правило, переоценить долгосрочные эффекты препарата прикладной, в то время как последний подход может страдать от изменчивости в ответ кинетики между испытаниями и ячейках. Ни один из этих альтернативных подходов адекватно могут различать рецептор деятельность в разных местах сотовой от же нейрона. Optogenetically активированный выпуска ACh был использован для исследования родной nAChRs9,10,11, но не оказалось полезным для сопоставления внутриклеточных nAChR мест. Кроме того большинство исследований с использованием этого подхода основывались на ChR2-выражая бактериальных искусственных хромосом трансгенные мыши с ненормальным холинергических передачи12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic фотолиз является не только оптические подход для изучения холинергических рецепторов. Клетке Карбахол использовался для функционально сопоставления ACh рецептор мероприятия в культивируемых клеток мозга и18 ломтики19, но не был коммерчески доступных для сравнительных исследований в ходе разработки PA-Nic. Рутений бис (бипиридин)-никотин комплекс (RuBi никотин) было сообщено для никотина uncaging20, но коммерческие препараты Руби никотин оказались хуже ПА-Nic в прямом сравнении исследование5. Это может быть полезно повторить такие сравнительные эксперименты с не коммерческих, высоко очищенный Руби никотин, как его видимым поглощения могут комплимент функций ПА-Nic для холинергических исследований. Наконец nAChRs также оптически манипулируют с помощью комбинации фото переключаемый лигандов и генетически модифицированные рецепторов21. Этот подход дополняет ПА-Nic фотолиз в ткани мозга, способность/требование генетических ориентации на изменение nAChR, рассматривается как преимущество и недостаток.
Следует отметить несколько ключевых требований этого подхода. Во-первых соответствующие визуализации метод необходим для точного поиска нейрональных мембран. Томограф с обычными epi флуоресцентной микроскопии может быть достаточно при изучении культивируемых клеток, но для записи от нейронов мозга ломтиками или других препаратов толстые ткани, 2PLSM или confocal микроскопии является требованием. Во-вторых подходящий метод необходим для позиции фотолиз лазерного луча. Этот подход использует двойной гальванометра сканирования головы с двумя независимыми x-y зеркала для сканирования растровых изображений луча и photoactivation точки, с помощью uncaging лазерный луч22,,23–24. Возможны другие, более ограниченные решения, например (1 один гальванометра сканирования головы, что альтернативно растровых сканирование изображений луча и uncaging пучка или (2) просто направляя uncaging луч в центре поля зрения, таким образом, что ячейка доводится до Эта позиция для flash фотолиза. В-третьих система необходима для одновременного электрофизиологических записи, если один хочет, чтобы собрать физиологических сигналов во время экспериментов. Вышеуказанные требования можно встретился с подходящей все оптических изображений техники, как недавно описан5. Ниже, подробный протокол включен, описываются ключевые шаги этого подхода.
Выбор способа доставки приложений ПА-Nic является наиболее важным этапом в этой технике локализованных фото стимуляции. Два метода, Ванна приложения и местные перфузии, каждый предлагают преимущества и ограничения. Выбор во многом повлияли nAChR уровня функциональные выражения в тип ячейки интереса. Часто бывает предпочтительнее использовать Ванна приложения при функциональных выражение уровни высоки, как ванна приложение позволяет для единообразного зонд концентрации, окружающих записанные ячейки, облегчения интерпретации данных. Ванна приложения также устраняет необходимость второго перфузии пипетки в ткани, что делает весь процесс легче. Однако Ванна применения дорогих соединений стоит больше за эксперимент.
Обычно устранение неполадок включает пытается понять, почему не nAChR активации видны следующие flash фотолиза. При работе с типом ячеек, который ранее не изучена с PA-Nic, следователь должен выполнять местные слоеного применение ACh или никотина, чтобы определить, являются ли достаточными рецепторов функционально выразил5. Чтобы проверить, что система способна обнаруживать фотолиз ответы, эксперименты контроля должно быть сделано в медиальной habenula нейронов, которые выражают большое количество рецепторов30. В этой области мозга ПА-Nic Ванна применение возможно, который является предпочтительным для проверки экспериментов. Только после выполнения этих экспериментов проверки следует один перейти к тип неизученный ячейки. Если экспериментальная система протестирована и ответы остаются очень малых или обнаружить, оно может быть оправдано увеличивают концентрацию PA-Nic, увеличение интенсивности вспышки или длительность импульса, добавьте nAChR положительные аллостерический модулятор для повышения nAChR деятельность6, или некоторое сочетание этих.
Иногда uncaging ответы являются слишком большими, с значительным nAChR активацию, приводящую к косвенным напряжения закрытом Na+ активации и unclamped внутрь течений из-за плохой пространства зажим. Эти артефакты, которые полностью скрывать внутрь токов nAChR и сделать невозможным интерпретации данных, могут быть устранены путем включения QX-314 (2 мм) в записи пипеткой. Они также могут быть устранены путем уменьшения концентрации PA-Nic или путем снижения интенсивности вспышки или длительность импульса. В всех видимый свет фото стимуляции экспериментах необходимо проявлять осторожность при выборе стимуляции сайты, чтобы избежать непреднамеренного стимуляции/фотолиз выше или ниже желаемого фокальной плоскости. Кроме того и когда применимо, мощность лазера должен всегда титруют воспроизвести физиологические реакции. Это особенно важно, необходимо знать о z-axis фотостимуляции при работе с клетке лигандов, как лиганды, которые активируются выше/ниже фокуса месте могут по-прежнему диффузный и взаимодействовать с биологической системы (т.е., рецепторов) изучается.
PA-Nic лазерной вспышки фотолиз может не подходить для всех следователей, как существуют некоторые ограничения. Во-первых, относительно высокая стоимость подходящие настройки. При работе с фрагментами нетронутыми мозга, uncaging вблизи малого диаметра структур как дендриты требует сложной визуализации системы как 2-Фотон микроскопа. Помимо высокой стоимости Ti: Sapphire, Перестраиваемый лазер импульсной IR для выполнения 2-Фотон микроскопии, двойной гальванометра системы, способной самостоятельно позиционирования двух лазерных пучков далее увеличивает стоимость системы. Расходы всего системы может быть уменьшена с помощью системы, дом построен, если следователь имеет достаточно опыта и времени для конструирования, устранения неполадок и поддержания такой системы. Второе ограничение часто предполагает низкий nAChR функциональных выражение, которое можно частично избежать, шаги, как упоминалось выше, но это не может гарантировать успеха. Как правило если одно не может измерить лиганд активированный течений после слоеного применение агонистов, ПА-Nic flash фотолиза под мембраной может не дать приемлемые результаты. Третье ограничение включает внутреннюю флуоресценции ПА-Nic. ПА-Nic поглощает свет ~ 405 нм и излучает в ряду аналогичных как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или Alexa 4885. Когда па-Nic концентрации превышают ~ 1 мм, это свойство флуоресцирования можно сделать это сложно одновременно визуализировать нейрональных структур. Чтобы избежать этого, важно иметь возможность легко управлять потоком PA-Nic из пипетки перфузии. Периодически ПА-Nic поток был остановлен разрешить флуоресцентных молекул для диффузного прочь. Это разрешается повторно изображений нейрона для проверки позиции месте uncaging луча. Четвертый потенциальным ограничением упоминать предполагает использование 405 нм света для фотолиза. Более короткие длины волн например 405 нм более подвержены рассеяния в сложные ткани, такие, как кусок мозга. Таким образом в данной флеш интенсивности и продолжительности, uncaging ответ амплитуд и Кинетика распада могут быть различной степени затронуты глубины uncaging фокуса внутри фрагмента. Выводы о биологических аспектах nAChRs следует учитывать этот важный нюанс.
Эта техника flash фотолиз локализованных лазерной недавно был использован раскрыть новые подробности о nAChR нейробиологии. Например хронический никотина воздействия повышает perisomatic и дендритных nAChR функции в медиальной habenula нейронов5. Он также использовался для помочь продемонстрировать, в первый раз, вентральной вентральная область глутамата нейронов Экспресс функциональных nAChRs в их perisomatic и дендритных сотовой отсеков6. Есть много потенциал будущего использования этой техники, и подход может быть применен к другим типам ключевых нейрон, которые известны Экспресс nAChRs, таких как корковых нейронов пирамидальный31 или интернейронов в коре32, стриатума33 и гиппокампа19. Этот метод может также сочетаться с фармакологии и/или nAChR гена, редактирование34 локализовать специфическим рецептором подтипы для различных нейрональных отсеков. Этот подход может быть легко адаптирована для других соединений, кумарина в клетке, включая, но не ограничиваясь, разработанные параллельно с PA-Nic5. Наконец ПА-Nic flash фотолиз может один день использоваться в Пробудитесь ведет себя животное для изучения действия никотина в Роман поведенческой фармакологии парадигм.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят лаборатории членов следующих северо-Главные исследователи: Райан Drenan, D. Джеймс Surmeier, Евгения Kozorovitskiy и Анис подрядчика. Эта работа была поддержана нас национальных институтов здравоохранения (НИЗ) (гранты DA035942 и DA040626 к Р.М.Д.БРИДСОН**), PhRMA Foundation (стипендии M.C.A.) и HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |