JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Fare beyin dilim Photoactivatable nikotin lazer Flash Photolysis üzerinden nikotinik asetilkolin reseptör işlevinde sondalama

Published: January 25, 2019
doi:
10.3791/58873
, , , ,
1Department of Pharmacology,Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Physiology,Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Janelia Research Campus,Howard Hughes Medical Institute

Summary

Bu makalede nikotin uncaging tarafından fare Beyin dilimleri nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChRs) çalışmak için bir yöntem sunar. Eşzamanlı yama kelepçe kayıt ve mikroskobu tarama 2-foton lazer ile birleştiğinde nikotin uncaging nikotinik reseptör işlevi kolinerjik Nörobiyoloji daha derin bir anlayış sağlayan hücresel morfoloji ile bağlanır.

Abstract

Asetilkolin (ACh) reseptörleri nöronal işlemler çeşitli modüle davranır, ancak ACh reseptör işlev nerede bu işlev yürütülür hücrelerde hücre altı konumu ile bağlamak için zor oldu. Nikotinik ACh reseptör (nAChRs) yerel beyin dokusu içinde hücre altı konumunu çalışmaya, optik bir yöntem nikotin nöronal membranların yakınındaki ayrı yerlerde kesin sürülmesi elektrofizyolojik kayıtları sırasında geliştirilmiştir. 2-foton lazer tarama mikroskobu sırasında onların morfolojisi görselleştirmek için yama klempe nöronlarda dilimleri ile dolu beyin boya ve nikotin uncaging hafif bir flash ile 405 nm lazer ışını bir veya daha fazla hücre zarları yakınındaki odaklanarak tarafından yürütülür. Hücresel geçerli deplasmanlar ölçülür ve bir yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntüsünü kaydedilmiş nöron nAChR yanıt-e doğru hücresel morfoloji ile mutabakatı sağlamak için yapılır. Bu yöntemi karmaşık doku müstahzarları, kolinerjik neurotransmission anlayışı geliştirmek için umut verici nAChR fonksiyonel dağılımın detaylı analiz olanak sağlar.

Introduction

Kolinerjik sinyal dikkatte kontrolü, istemli hareketi ve ödül1,2de dahil olmak üzere çok sayıda beyin süreçleri modüle. Asetilkolin (ACh) iletim artıran ilaçlar Alzheimer Hastaligi, biliş3kolinerjik sistemleri için önemli bir rol ima ile ilişkili kognitif bozukluk tedavi etmek için kullanılır. Kolinerjik reseptörler ve sağlıklı ve hastalıklı Birleşik devre geliştirilmiş bir anlayış daha iyi tedavi yaklaşımları çeşitli nörolojik hastalıklar/bozuklukları için neden olabilir.

Nikotinik ACh reseptör (nAChRs) veya yanıt olarak endojen ACh eksojen nikotin tütün ürünleri katyonlar akı ligand kapılı iyon kanalları bir aileyiz. Açıklanan4olmak ilk nörotransmitter reseptörleri arasında olduğu gerçeğini göz önüne alındığında, nAChR Farmakoloji ve kas lifleri konumda kas tipi reseptörler için iyi anlaşılmış. Buna karşılık, nispeten az Farmakoloji ve yerel nAChRs beyinde hücre altı dağıtım hakkında bilinir. Bilgi serisindeki bu boşluğun son dağınık şekilde sınırlı ve hızlı harekete geçirmek-in nAChRs beyin dokusunda hücresel görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt5sırasında için izin veren bir roman kimyasal sondası geliştirme tarafından ele alındı. Burada, anahtar metodolojik adımlar bu yaklaşımda, nöronal yapısıyla nAChR işlevi bağlanma olanağı geliştirme genel amacı ile açıklanır.

Photoactivatable nikotin (PA-NIC; kimyasal adı: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] coumarin-4-yl] metil-nikotin) ~ 405 nm lazer flaşlar verimli bir şekilde nikotin5,6serbest bırakmak ile photolyzed olabilir. Uncaging önce PA-NIC çözümde kararlı ve hiçbir uygunsuz farmakolojik veya fotokimyasal özellikleri5sergiler. Photolysis sonra serbest bırakılan nikotin tahmin edilebileceği gibi nAChRs etkinleştirir ve farmakolojik etkisiz5uncaging yan vardır. Sürekli bir lazer bir çıkış gücü ile photolysis ışık kaynağı olarak kullanılan > 1 mW ölçülen örneği ‘. Ne zaman lokalize, hedeflenen fotoğraf-stimülasyon hücresel zarları mikroskobu (2PLSM) tarama 2-foton lazer ile bulmak için yeteneği ile birlikte ve iki önemli avantajı olan bu yaklaşım tamamen gerçekleştirilmektedir: photolysis hız ve kayma kesinlik.

Çoğu bakımdan photolysis PA-NIC nAChR ligandlar reseptörleri Beyin dilimleri içinde teslim etmek diğer yöntemleri üstündür. Böyle bir yaklaşım banyo uygulama7 ve yerel uyuşturucu teslim yolu ile bir kirpi pipet8içerir. Eski yaklaşım uygulanan ilacın uzun vadeli etkileri aşırı vurgulamak eğilimindedir ise ikinci yaklaşımı yanıt kinetik hücreleri ve denemeler arasında değişkenlik muzdarip. Bu alternatif yaklaşımlardan hiçbiri yeterince aynı nöron farklı hücresel konumlardan faaliyetlerine reseptör ayırt edebilirsiniz. Optogenetically-harekete geçirmek yayın ACH yerli nAChRs9,10,11soruşturma için kullanılan, ancak eşleme hücre altı nAChR mekanlar için yararlı olmuştur değil. Ayrıca, çoğu çalışmalar bu yaklaşımı kullanan bir ChR2 ifade bakteriyel yapay kromozomu transgenik fare ile anormal kolinerjik iletim12,13,14, dayanıyordu 15 , 16 , 17.

PA-Nic photolysis kolinerjik reseptörler eğitim için sadece optik yaklaşım değildir. Kafese kapatılmış bir carbachol işlevsel olarak ACh reseptör faaliyetleri kültürlü hücreleri18 ve beyin dilimleri19eşleştirmek için kullanılan, ancak PA-NIC geliştirilmesi sırasında karşılaştırmalı çalışmalar için ticari olarak mevcut değildi Rutenyum BIS (bipyridine)-nikotin karmaşık (RuBi-nikotin) nikotin uncaging20için izin vermek için rapor ama RuBi-nikotin kafa kafaya karşılaştırmada PA-NIC için aşağı kanıtladı ticari hazırlıklar çalışma5. Ticari olmayan ile karşılaştırmalı tür deneyler tekrarlamak yararlı olabilir son derece saf RuBi-nikotin, onun görünür emme PA-Nic’s Özellikler kolinerjik çalışmaları için iltifat gibi. Son olarak, nAChRs aynı zamanda optik fotoğraf değiştirilebilir ligandlar ve genetiği değiştirilmiş reseptörleri21‘ in birleşimiyle manipüle. PA-Nic photolysis görülen bir avantaj ve bir dezavantaj değiştirilmiş nAChR genetik hedefleme yeteneği/şartı ile beyin dokusu içinde için tamamlayıcı bir yaklaşımdır.

Bu yaklaşımın birkaç anahtar gereksinimleri olması gerekmektedir. İlk olarak, uygun görselleştirme yöntemi doğru nöronal membran bulmak için gereklidir. Kültürlü hücreleri okurken geleneksel epi-floresans mikroskobu ile görüntülemede yeterli olabilir ama beyin dilimler veya diğer kalın doku hazırlıklar nöronlarda kayıt için 2PLSM veya confocal mikroskobu bir gereksinimdir. İkinci olarak, uygun bir yöntem photolysis lazer ışını konumlandırmak için gereklidir. Bu yaklaşım bir çift-galvanometre tarama kafa raster görüntüleme kiriş ve nokta photoactivation uncaging lazer ışını22,23,24kullanarak tarama için iki bağımsız x-y aynalar ile kullanır. Diğer, daha sınırlı çözümleri alternatif olarak raster görüntüleme ışın ve uncaging ışını veya hücre getirdiği için öyle ki (2) sadece uncaging ışını görüş alanı ortasına yönetmenlik inceden inceye gözden geçirmek olduğunu (1) bir tek-galvanometre tarama kafa gibi mümkün Bu pozisyon için flash photolysis. Üçüncü olarak, Eğer bir fizyolojik sinyalleri deneyler sırasında toplamak dilek eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt için gerekli bir sistemdir. Yukarıdaki şartları uygun bir all-optik görüntüleme tekniği ile son zamanlarda açıklanan5olarak karşılanabilir. Aşağıda, detaylı bir iletişim kuralı eklenir Yani bu yaklaşımın temel adımları açıklar.

Protocol

Beyin dilim hazırlık için ilgili iş gözden geçirilmiş ve Northwestern Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (protokol #IS00003604) tarafından onaylanmış. Uyarı: Noktası fotoğraf-uyarılması için kullanılan lazerler gözlere zarar potansiyeline sahip görünür sınıf IIIB lazerler vardır. 2PLSM gerektirir bir yakın kızılötesi (Nur) Sınıf IV lazer (> 500 mW), diğer dokularda gözleri ve hatta yanıklar ciddi zarar potansiyeline sahip olduğu. Uygun lazer ışını Koruma, sistem kilitler, artı mühendislik ve yönetim denetimleri lazer donatımı güvenli çalışmasını sağlamak için gereklidir. Her zaman yerel lazer güvenlik personeli lazerler ile çalışırken aramak. 1. kalibrasyon ve doğrulama Uncaging lazer Örnek için teslim edilecek lazer güç ölçmek. 405 nm lazer (100 mW maksimum güç ile 5 V kumanda sinyal) açın ve lazer sistemi yaklaşık 10 dk kadar sıcak.Not: Lazer hala (0 V sürücüyle) kapattılar ve lazer bir kontrol voltajı çıkış gücü modüle gönderilene kadar hiçbir çıkış güç yoktur. Bir güç ölçüm doku örneği düzlemde veya kondenser lens yerine yerleştirin. El ile optik yol/objektif lens göre metre ortalayın. (400-1100 nm) doğru dalga boyu aralığına metre ayarlamak. Metre uygun Farenizde tarafından sıfır. Yazılım denetimleri kullanarak 100 seçin (en fazla 1000 out; 1000 = 5 V) lazer tam güç % 10’una ayarlar 405 nm lazer güç için. İstenirse, lazer kontrol voltajı da PrairieView sistem yolu ile komut dijital kaydını sağlamak için VoltageRecord beslenebilir sinyal zamanlama ve güç seviyesi. Güç metre okunurken kaydedin. 405 nm lazer güç çıkışı için 150 (en fazla 00 15) seçin ve güç metre okunurken kaydedin. Bu bir lazer güç eğrisi toplamak aşağıdaki çıkış güçleri için işlemi yineleyin: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ve 1000. Uncaging lazer galvanometreler kalibre. Orada değişiklik yapıldığında sisteminin optik bileşenleri için doğru nokta konumlandırma veya düzenli olarak her ay hakkında bir endişe olduğunda aşağıdaki adımları yürütün. Su daldırma mikroskop objektif kullanılacak olan lens x 60 photostimulation ve görüntüleme deneyler yükleyin. 60 x objektif lens ve optik zum ayarı 1 edinme/görüntüleme yazılımı seçin (bkz. Adım 3.1.4.2.). Dolu daire temiz cam mikroskobu slayt üzerine kırmızı kalıcı bir kalem ile işaretleyin. Slayt marker doğru amacı ile mikroskop sahnesinde yerini. Mikroskop kırmızı işaret bölgesindeki bir 4 x veya 10 x amacı ile önceden odaklan. Kırmızı işaret nokta/spot başına 1-2 mL su ekleyin ve sonra 60 x amaç için geçiş ve amacı suya daldırın. İnce kırmızı işaret bölgesindeki objektif lens odak. 2-foton lazer tarama için geçiş. Çoğu sistemler, taret pozisyon #1, trinocular prizma ışık yolunu dışarı hareket tarama baş ayna önüne taşı taşımak ve lazer dalga boyu ~ 900 ayarla nm. Stimülasyon ayna kalibrasyon rutin için varsayılan piksel ögesi olan görüntü edinme parametreleri, 512 x 512 piksel kutusu seçeneğini belirleyin. En az büyük bir görüntüleme lazer güç ile tarama sistemi başlatın ve ince ince kırmızı işaret floresans katman üzerine objektif odak ayarını yapın. Bir alan floresans alanında enkaz açık ve eşit olarak kaplanmış marker ile seçin.Not: Bu iletişim kuralı kurulumunda PrairieView 5,4 edinme/görüntüleme yazılımı kullanır. Yazılım araçları – kalibrasyon/hizalama menü içinde Uncaging Galvo kalibrasyon işlevini açın. Noktalar yanmak eğitimi ikinci galvanometre ayna çift kayma kalibrasyonu için yol gösterecek. 405 nm lazer noktalar yanmak öğretici içinde seçin, 400 lazer stimülasyon gücünü ve bu küçük verim 20 Bayan bir stimülasyon süresi seçin (~ 1-5 µm çapı) kırmızı işaret delikler.Not: Ayarları ~ 2-4 gibi mW ve 1-10 ms tipik olarak kullanılır, ancak ayarlar örnek tarafından belirlenir. PA-NIC fotoğraf-stimülasyon güç ayarlarını kalibrasyon sırasında kırmızı işaretçisi slayt görünür bir delik ablate için gerekli gücü daha düşük olması muhtemeldir. Bu kalibrasyon rutin photostimulation noktalar bulmak için yararlıdır ancak fizyolojik yanıt sırasında mutlak photostimulation birimleri anlaması için kullanılmamalıdır. Teşvik ve merkez nokta yakmak ve yuvarlak kırmızı gösterge gerçek nokta konuma gidin sonra görüntüyü yenilemek için güncelleştirme ‘ yi seçin. Bunu yapmak için merkez nokta, doğru merkez nokta, alt merkez nokta ve son olarak dokuz noktalar (tüm köşeler ve kenarlar artı görüntü Merkezi) oluşan bir kılavuz için.Not: Orta, sağ ve alt düzeltilmiş nokta konumları gerçek merkezi ve X ve Y ölçekleme faktörleri stimülasyon ayna Çift görüntüleme ayna çiftine eşleşecek şekilde tanımlamak için stimülasyon galvanometre gerilimleri belirler. Yazılım ölçekli ve güncelleme, kayma kalibrasyon zoom farklı yakınlaştırma değerlerinde gerçekleştirilen tüm izleyen MarkPoints deneyler. Kalibrasyon MarkPoints pencere açıp el ile etkinleştirme örnek yeni bir alanda tanımlanan spot(s) stimülasyon parametrelerinde sınayın. Doğru en son kalibrasyon dosyası MarkPoints penceresine yüklü emin olun. Tanımlanmış bir spot(s), MarkPoints/grup veya MarkPoints serisi özelliğini etkinleştirmek veya görüntü sırasında canlı bir test darbe uygulamak için tarama üzerinde herhangi bir yere sağ/sol klik Live/ablasyon özelliğini kullanmak ve doğru kalibrasyon doğrulamak için.Not: Lazer yanık spot şimdi mükemmel MarkPoints göstergesi üzerinde merkezli. Lazer darbe güç ve geçici süre belgili tanımlık harekete geçirmek VoltageRecord programa kapalı sürücü gerilim dokunarak kaydedilecek (bkz. Adım 1.1.4). Benzer şekilde, fotoğraf-stimülasyon galvanometre aynalar çifti türetilmiş geribildirim sinyalleri ölçekli voltaj sinyalini kullanarak her stimülasyon spot konumunu kaydeder. 2. Photoactivatable nikotin (PA-NIC) hazırlanması Bir aliquot photoactivatable liyofilize ilaç depolama–dan almak.Not: Aşağıdaki iletişim kuralı PA-NIC için özeldir; diğer photoactivatable uyuşturucu için gerektiği gibi ayarlayın. Olağanüstü istikrar5PA-NIC gösterir, hazırlık ve/veya deneyler sırasında onu parlak ışığa maruz kalma korumak için gerekli önlemleri almak. Bu sadece düşük ışıkta çalışarak gerçekleştirilebilir; Filtre uygulanmış kırmızı ışığa sınırlama gerekli değildir. PA-NIC yerel uygulama gerçekleştirmek 20-40 µm ile bir programlanabilir pipet çektirmenin bir açılış çapı ile cam micropipette çek. ~ 1 mL çözüm 0,22 µm filtresiyle kaydetme filtre. PA-NIC bir miktar 2 mM son bir konsantrasyon verim için filtre uygulanmış kayıt çözüm resuspend. Örneğin, filtre uygulanmış kayıt çözüm 50 µL içinde 100 nmol liyofilize aliquot geçiyoruz.Not: Önerilen kayıt çözüm kompozisyon PA-Nic photolysis istihdam son yayınlar5,6 ‘ bulunabilir. Arka-dolgu yerel uygulama pipet ile 2 mm PA-NIC 50 µL Bir micromanipulator üzerinde monte edilmiş bir pipet tutucusuna yerel uygulama pipet güvenli. Pipet uygun boru tutucu üzerinden bir basınç Fırlatma sistemi sürekli alçak basınç uygulanması (1-2 PSI) yeteneğine sahip bağlayın. Micromanipulator kullanarak, yerel uygulama pipet ekstraselüler kayıt çözüm ve ~ 50 mikron ilgi hücreden pipet ucu biraz fare beyin dokusu üzerinde bulunan pozisyon içine manevra. Bir önceki rapor fare beyin dilim hazırlık ve yama kelepçe kayıtları8detaylı bir protokol için başvurun. Kısa bir süre (1-2 PSI) basınç uygulayarak uygulama parametreleri denetleyin. Hücre ilgi herhangi bir öteleme için en az olmalıdır. Önemli hareket etmiyorsa, daha fazla uzaklıkta (yanal ve/veya eksenel yönde) bulunan yerel uygulama pipet faiz hücreden yeniden konumlandırın. İstikrarlı tüm cep telefonu yama kelepçe elde sonra (Ayrıntılar için hangi bir önceki yayın8′ de dahildir), basınç fırlatma aygıtındaki uygun manuel anahtarı kullanılarak düşük basınç (1-2 psi) uygulama açın. PA-NIC ile hücre için bir sonraki adıma devam etmeden önce 1-2 dk çevreleyen doku doyurmak. Beyin dilim için banyo uygulaması (superfusion) PA-NIC gerçekleştirin. PA-NIC bir miktar çözüm sürekli devridaim 100 mikron son bir konsantrasyon vermeye uygun kayıt bir birimdeki geçiyoruz. Örneğin, bir standart 15 mL tüp kullanarak kayıt çözüm 10 mL 1 μmol aliquot geçiyoruz. Devridaim 1.5-2 mL/dk hızında PA-NIC çözümün perfüzyon sistemi uygun akış denetimi açarak başlayın. Devridaim kayıt süresi için oluşur. Değerli uyuşturucu tasarruf etmek için devridaim birim boru ile en az bir iç çapı kullanarak, ve/veya perfüzyon sisteminde kullanılan boru genel uzunluğunu kısaltmak en aza indirmek.Not: Bu adımları izleyerek, banyo devridaim için ses PA-NIC çözüm için 5 mL azaltılabilir. PA-NIC çözümleri kez kullanılabilir için iki ardışık gün aynı hafta içinde depolanmış olsa kayıt korumalı ışık 4 ° C’de Devridaim sırasında sürekli olarak carbogen (%5 O2, % 95 CO2) ile çözüm kabarcık ve banyo sıcaklığı 32 ° C’de korumak Çözüm düşük ışık koşullarında PA-NIC ile çalışırken kayıt beyin dilim korumak. 3. görüntüleme nöronlar ile 2-foton lazer mikroskobu tarama Hücrenin canlı görselleştirme gerçekleştirin. İletilen ışık kullanarak bir medial habenula (MHb) nöron tanımlamak/görselleştirmek veya Kızıl ötesi fark girişim kontrast (IR/DIC) optik ve bir video kamera ve istikrarlı tüm cep telefonu yama kelepçe kayıt kurmak. Nöronlar akut hazırlanan fare Beyin dilimleri8’ den önceki bir protokol yama kelepçe kayıtları hakkında ayrıntılı bilgi için bakın. Yüksek mukavemetli kurduktan sonra (> 1 GΩ) hücre bağlı yapılandırma, ama önce zorla girme, kurulum ve yazılım tarama modunu lazer geçiş. Sonra içeri girmenin, lazer tarama doğrulamak için bir görüntüleme boya kullanın (100-200 son bir konsantrasyon seyreltilmiş µM standart hücre içi pipet çözüm içine daha önce8açıklanan) pasif (difüzyon) tarafından nöron doldurma. Boya (Örneğin, Alexa Fluor 488 yeşil photomultiplier tüp [Devresel_ödeme] Kanal, Devresel_ödeme 2; veya Alexa Fluor 568 veya 594 kırmızı Devresel_ödeme kanal, Devresel_ödeme 1) görselleştirme gerektiren deneyler denemeden önce en az 20-30 dk için hücresel kompartmanlarda doldurmak için izin herhangi bir hücresel kompartmanlarda soma dışında.Not: Distal bölmeleri (dendritik yapıları, omurgalar, akson, vb.) 30-40 dk25tamamen doldurmak için gerekli olabilir. Nöron ve hücre altı bölme ilgi görselleştirmek için yazılım Live tarama işlevini kullanın. İzin vermek için doğru görüntüleme parametreleri görselleştirme nöronal özellikleri canlı seçin. Etkiler veya görüntü görselleştirme (kontrast), çözünürlük, sinyal-gürültü oranı (S/N) ve görüntü çerçeve satın alma zaman değiştirmek için çeşitli ayarları değiştirmek: Look up tablo (LUT). Herhangi bir görüntü penceresinin kenarında uygun simgesini kullanarak LUT penceresini açın. Bir kez aç, LUT kat (dk) ve ekranda gösterilen sinyal kontrast görselleştirme geliştirmek için tavan (en çok) ayarı belirli görüntü kanalı ayarlayın. ~ Dimmer ilk hücreler için arama yaparken sinyalleri, sinyal ve yapısı çekmek için yardımcı olacak 1000 (dışarı-in 4096, 12-bit algılama), maksimum değerine indirin.Not: Bu ayarlar yalnızca görüntülenen sinyal değil tespit/kaydedilen değerler etkiler. İnsan gözü genellikle sadece kontrast ~ 50 gri düzeyleri26için yapabilirsiniz. Optik zoom. 1 X görme duyusuyla ilgili vınlamak ve doku istenen alanı bulmak için denetimleri kaydırma kullan seçmek için yazılım denetimleri kullanın. Bu yakınlaştırma ayarını en büyük Meydanı verimleri, görüş alanı inceden inceye gözden geçirmek ve en büyük gerilim/tarama açıları, galvanometre aynalar için gönderir.Not: 12 mm objektif büyütme örnek içinde bölünür çevirir tarama kafanın içinde görüş 12 mm x 12 mm alanı için varsayılan yapılandırma budur. Bu nedenle, bir 60 x objektif lens verimleri taranmış görüntüleri yan başına 200 µm, 1 x görme duyusuyla ilgili vınlamak. Daha yüksek optik zum değerleri daha az alan tarama. 2 x görme duyusuyla ilgili vınlamak sık sık en yararlı bütün nöronlar görüntülenmesi için ayardır. 4 x nöron hücre altı yönleri görüntülenmesi için yararlı olabilir. Piksel sayısını. 1 x optik zum tamamlayacak, yazılım denetimleri kullanarak satır başına 1024 x 1024 piksel seçin. Yakalanan ve görüntülenen görüntü objektif lens ayrıntıları mümkün kaybetmek değilsatır başına piksel sayısını ayarlayın. Aşağıdaki pratik piksel değerlerini bir 60 x kullanın / 1.0 sayısal diyafram (NA) Amaç: 1024 x 1024 için 1, zoom 2 512 x 512 ve 256 x 256 için zoom zoom 4. Son piksel boyutu (~0.17 µm; 12 mm/büyütme/zoom/piksel) yarım veya daha az, objektif lens tarafından tanımlanan yanal çözünürlük olmalıdır.Not: Görüntü çözünürlüğü sadece lazer dalga boyu ve objektif NA tarafından tanımlanır (0.4 µm çözünürlükle iki fotonlu heyecanlı [2PE] dan 920 nm ve 1.0 NA objektif)27. Ölçütü için tam uyarma NA, lens üzerinde listelenen olarak bu lazer ışın çapı maçlar 1/e2 yoğunluğunu (ya da “doldurur”) giriş öğrenci (2 tüp lens odak uzaklığı x NA x / büyütme) objektif lens. Burada açıklanan sistem tüp objektifte 180 mm odak uzunluğu vardır. Piksel Işınma Zamanı . Yazılım denetimleri 4 µs piksel Işınma Zamanı, yararlı varsayılan bir değer seçmek için kullanın.Not: Piksel Işınma Zamanı değiştirmek demek sinyali algılandı değiştirmez; Sadece içi pikselin ortalama etkiler ve bu değişiklikleri S/N. üzerinden görüntü kalitesi ile görüntülenir Görüntü piksel Işınma Zamanı her zaman 0,4 µs birimleri katı ve 12-bit-sınırlı yoğunluğu kez daha büyük yaşamak için her görüntü piksel 0,4 µs örnekleri ortalama değeridir. S/N oranı örnek / piksel Işınma Zamanı (4 µs eşittir on örnekleri veya S/N 3.16-fold düzelme) sayının kare kökü olarak geliştirir beri görüntü kalitesi düzelme 12 µs çok büyük değerler için döner azalan ulaşır. Tarama döndürme ve bölge (ROI) ilgi. Görüntü açısı (0 ° döndürme görüntüleme sistemlerinin çoğu için varsayılan ayar olarak herhangi bir işlem, gerekli olabilir) yazılım denetimleri kullanarak 0 ° döndürme için ayarlayın. Örnek bir “ters” yönde yerleştirilmiş olması durumunda, 180 ° dönüş “resmi döndürmek için” seçin.Not: Görüntü, verilen herhangi bir açıda döndürme ilgi dolu hücrenin tüm alanı için daha iyi bir uyum sağlayabilir. Rotasyon da bir daha net olarak yapısal değişiklikler hizalamak için ve daha sonraki analiz gerçekleştirmek için yol açabilir. Bir bölge seçerek bir verilen zoom (adım 3.1.4.2) ayarını korur , taranan resmin içinde yerel piksel sayısı (adım 3.1.4.3) faiz ama sağlayarak toplam sayısı alanı ve piksel olarak kısıtlama önemli ölçüde kare hızı artırabilir sinyal değişiklikleri geliştirilmiş zamansal çözünürlük. Çerçeve ortalama. 2 kare yazılım denetimleri kullanarak başlangıç çerçeve ortalama ayarı seçin.Not: Son görüntü kontrastı (S/N) toplanan/tespit görüntü sinyali piksel içinde toplam fotonlar tarafından tanımlanır. Sağlanan örnek hareket etmez veya görüntüleme sırasında ağartılmış değil birden çok görüntü kareleri ortalaması S/N oranı artırabilir. Faiz sinyal gürültü görüntüdeki ortalama kare kare kökünü tarafından azalır iken çerçevenin ortalama sırasında aynı değer olarak kalır. Floresans görüntüler küçük yapılar genellikle arası piksel piksel görüntü (ROIs adı da verilir) ve/veya ortalama çerçeve içinde birleştirerek ortalama gerektirir. Ortalama scanning zaman görüntüleri kişi sayısına göre artar ortalama kare seçer. Tarama sırasında örnek konuma yönlendirmek için Kontrol Pan, Dönme inceden inceye gözden geçirmekve Optik yakınlaştırma araçlarını kullanın. Motor sahne işleme örnek yerleştirmek için gereken ise, amaç/kondansatör çarpışmalar, titreşimler veya pozlama lazer ışınının yansıtıcı yüzeyler için önlemek için X, Y ve Z ekseni için büyük adım boyutları kaçının. Bir Z-yığın toplamak. Z-Serisi aracını kullanarak, bir başlangıç seçin ve faiz hücresi pozisyon durdurmak. Adım boyu (1 µm) seçin ve sonra arka arkaya nöron düzlemde her Z-hücreyi içeren görüntü.Not: Z-yığın alma ayarları nöron türü ve boya dolum arasında değişir. Z-yığın alım için en uygun parametreleri bağımsız canlı görüntüleme için kullanılan parametreler olarak tespit edilmelidir. Z-yığın edinme önce ve/veya optopharmacology deney sonrası gerçekleştirilebilir. 2PLSM ve küçük hücresel kompartmanlarda en iyi boya dolgu için izin vermek için herhangi bir hücresel hasarı önlemek için optopharmacology indüklenen sonra mümkünse, Z-yığın edinme gerçekleştirin. 4. lazer Flash Photolysis elektrofizyolojik kayıtlar sırasında Not: Uygulama 405 nm veya 473 nm lazer gücü ≥ 1 mW üreten yakamoz objektif ve kondansatör lensler bardak içinde. Oluşturulan bu ışık lazer aydınlatma gücüne doğrudan ilgilidir; emisyon yeşil ve Kırmızı spektral pencerelerini de varsa ve heyecanlı-devlet yaşam süreleri ms aralığında. Bu arka plan stimülasyon obje tüm lensler test ve su daldırma objektif lens objektif lens tüm büyük üreticilerin görmüş. Kondansatör lensler daha objektif lensler çok daha yüksek yakamoz üretmek. Bu “sinyal” hassas galyum arsenide fosfit (GaAsP) Devresel_ödeme katotlar korunması fotoğraf-stimülasyon olaylar sırasında için mekanik perde kullanım motive eder. Normalde kapalı bir mekanik obtüratör (değil, aktif tararken kapalı) kullanarak soğutmalı GaAsP PMTs korunması için en iyi çözüm temsil eder. Bir kum saati-tipi photostimulation ışını geometri için herhangi bir odak lensler Aksi halde dar/lazer ışını objektif giriş öğrenci girerken sıkmak ışık yolunu optik kaldırın. MarkPointskullanarak, tek nokta ayarını seçin.Not: Diğer fotoğraf-dürtme ayarları (birden çok lekeler, noktalar, tarama sarmal oluşan bir kılavuz) MarkPointsiçinde mümkündür. Tek nokta en basit olanıdır. Deneysel hedefleri ve biyolojik farklılıklar farklı bir ayar gerekli. Kısaca görüntü ve ilgi hücre altı alanı bulmak için Live tarama seçeneğini kullanarak görüntüyü güncelleştirmek. Periyodik olarak herhangi bir potansiyel küçük sürüklenir odak tanımlamak için resmi güncelleştirmek. Görme duyusuyla ilgili vınlamak artırmak için yazılım denetimleri kullanın (yani, mevcut olandan daha yüksek bir optik yakınlaştırma ayarı seçin), gerekirse, küçük yapıları (yani, dikenleri ya da distal dendrites) görselleştirmek. MarkPoints tek nokta hedef işaretini hemen bitişik (~0.5 mikron) hücre zarı için yerleştirin. Yer yer fotoğraf stimülasyon doğrudan hücresel bir özelliğin üzerindeki bu duyarlilik için neden olabilir. Fotoğraf-uyarılması için parametrelerini ayarlamak MarkPointsiçinde yazılım denetimleri kullanarak. Başlangıç kurallar aşağıdaki şekilde uygulanır: 1-50 ms süre, 1-4 mW lazer güç ve ≥1 deneme. MarkPoints Protokolü başlatmak ve Elektrofizyoloji veri toplama gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için Çalıştırmak MarkPoints seçin. 4.2-4.7 birkaç kez tutarlılık ve kararlılık değerlendirmek ya da yokluğundan, yanıt genlik ve kinetik için yineleyin.

Representative Results

Photolysis için stimülasyon, maruz kalma doz (yoğunluk ve saat), pozlama konumunu ve ışın geometri önemli değişkenlerdir. Bu makalede açıklanan sistem iki farklı photostimulation demeti, galvanometre sistem ışın girmeden önce photostimulation ışık yolunu bir lens ın/out hareketli ayarlanabilir üzerinden yeteneğine sahiptir. Bu lens photostimulation eni 60 x giriş öğrenci doldurur / 1.0 NA su daldırma-[60 x WD] Amaç, bir yakınındaki kırınım-sınırlı, alt-µm buluşma noktasında örnek içinde odak düzlemi üreten. Bu photostimulation üstündeki ve altındaki odak nokta ile optik eksen simetrik uzanan bir kum saati şekli ile ışık ile ilişkilidir. Yola eklenen lens ile photostimulation lazer ışığı objektif lens giriş öğrenci odaklanmıştır ve bir kaleme benzer ışın çıkar. ~ 10 µm çapı 60 x amaç için olması bekleniyor, bu ışın düzgün/dikey örnek boyunca gösterilir. Bu modda, stimülasyon nokta içinde verilen herhangi bir yerde ışık şiddeti kırınım sınırlı yakınındaki küçük nokta yoğunluğu % ~ 1 olacaktır. Böylece, daha yüksek lazer gücü ~ 10 µm spot stimülasyon kullanırken genellikle gereklidir. Bu makalesinde bildirilen tüm deneyler için bir kum saati-tipi photostimulation ışını kullanıldı. Teslim edilen örnek güç karşı bir güç ölçeri kullanmayı örnek lazer güç ölçme sonra giriş voltaj ayarı çizilebilir. Bu çalışmalar bir 60 WD amaç x 2 mm ile bir çalışma mesafesi kullanın ama dedektörü öğesi olabilecek hasarları önlemek güç ölçümler için suda Batık değil. Ne zaman hedefleri ile NA listelenen > 0,95 hava (olmadan daldırma sıvı) cinsinden ölçülür, objektif ön yüz element alt dizin (hava) nedeniyle toplam iç yansıma kayıp olabilir. (Toplam iç yansıma kayıpları için düzeltmek için) Bu durumda, bir daha doğru örnek güç ölçüm için havada ölçülen 1.0 NA objektif (1.0/0,95)2 tarafından ölçülen gücünü artırmak. Şekil 1a gösteren tipik bir giriş/çıkış arsa için 405 nm lazer dahil edilmiştir 473 nm görünür lazerler denize indirmek ve bu çalışma sisteminde. Bu lazer sistemleri aşağıdaki nedenlerden dolayı fotoğraf-stimülasyon maruz kalma doz kontrolü için idealdir: (1) giriş voltajı göre doğrudan Lineer güç çıkışı sağlamak için önceden ayarlanmış (0-5 V), (2) (hiçbir lazer ile bir sessiz çekim işlemi sağladıkları çıkış), ve (3) onlar-si olmak hızlı, alt-ms yoğunluğu darbe süresi kontrolü (0.1 ms yanıt). Spot fotoğraf-uyarılması lazer/galvo sistemle kullanırken, MarkPoints noktalar rutin kalibrasyon gerekli bir görevdir. Şekil 1b (sol kapı aynası) kalibrasyon dışında olan bir sisteme gösterir (fotoğraf uyarmak için istenen nokta değil neden bu noktaya doğru uyarılması yanık delikli konumu tarafından belirtildiği gibi), doğru nokta kalibrasyon ( sonra konumlandırma için dönüş ile Şekil 1b, doğru kapı aynası). PA-NIC alçakgönüllülükle Floresan (emisyon zirvesinde ~ 510 nm), 350-450 nm (1-foton uyarma) veya 700-900 nm (2-foton uyarma)5arasında etkili uyarma sergilenmesi. PA-NIC sırasında yerel uygulama görselleştirmek için PA-NIC (1 mM) (1) beyin doku optik kesitli iletim bağlam eşzamanlı görüntüleme tarafından Dodt kontrast ve (2 verilmiş floresans uyarma takip beyin dokusu yakınındaki uygulandı (900 nm), PA-NIC PA-Nic 2PE floresan bir yerel uygulama pipet (Şekil 2a) gelen basınç fırlatma sırasında kolayca algılanabilir. Nikotin ve bir monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metil coumarin, ana PA-Nic photolysis reaksiyon5fotokimyasal ürünlerdir. PA-NIC için Imaging kullanılan ayarları/parametreleri Imaging kullanarak, doku nikotin (1 mM) veya 7-carboxymethylamino-4-metil coumarin (1 mM) teslim sırasında görüntüsü. Floresan sinyal algılandı (Şekil 2a, orta ve alt paneller), PA-NIC sonuçları özgüllük gösteren. Son olarak, PA-NIC beyin dokusu içinde uygulandığı ve PA-NIC floresans emisyon görüntüsü (Şekil 2b). Bu yaklaşım PA-NIC yerel uygulama pipet 100-200 µm içinde mevcut olduğunu onaylar. Birlikte, bu veriler PA-NIC beyin dokusu ile yerel uygulama için etkili bir şekilde teslim onaylamak. Elektrofizyoloji kayıtları görüntüleme hücresel yapıları için aynı anda 2PLSM ile denge hakkında önemli noktalar için her iki bileşenin deneme için araştırmacı gerektirir ve genellikle bir dar zaman penceresi (~ 20 dk) için kullanılabilir geçerli örnek veri toplama yamalı bir hücreden. Hücresel görselleştirme dikkate almadan, bu zorla girme istikrar kayıt çünkü zamanla düşüş eğilimi sonra en kısa zamanda kaydetmeye başlamak için en iyi yöntemdir. Ancak, düşsel bir gereksinimi olduğunda, elektrofizyolojik dikkat edilmesi gereken noktalar küçük/uzaktan yapılarda floresans konsantrasyonu artar için yeterli zaman izin vermelidir. Bu eğri28, bazen ne zaman yeni bir hücre tipi görüntüleme türetmek yararlı olan doldurma bir boya konsantrasyon inceleyerek örneklenir. Şekil 3 Z-yığınlar 2PLSM görüntülü ve maksimum yoğunluk projeksiyon tanıtımı amacıyla içine çökmüş birkaç örnek nöronlar gösterir. Şekil 3a nerede nöronal morfoloji tam olarak düşünülür, gürültü en aza indirilir ve enkaz hücresel morfoloji yorumu ile müdahale değil yüksek kaliteli görüntüleri gösterir. Şekil 3b daha düşük kalite, düşük sinyal arka plan oranı ve önemli enkaz görüntüleri gösterir. Bu enkaz kez hücre yaklaşırken boya yama pipet üzerinden görüntüleme fırlatma kaynaklanan yoğun floresans küresel cepler olarak görünür. Özellikle 100 µM eklenmesi PA-Nic banyoda (banyo uygulama yapılırken) sinyal arka plan oranı azaltmak eğilimindedir ve alt-optimal görüntü kontrastı için yol açar. Alexa Fluor 568 veya 594 kez yerel uygulama deneyler oldukça yararlı bir bulucu boya veya normalize 2PE başvuru/normalleştirme sinyal olarak. Bu boyalar iki fotonlu uyarma için etkili bir dalga boyu hangi bırakmak PA-NIC eş zamanlı görselleştirme ve hücresel kompartmanlarda tanımlaması ~ 780 nm27, var. Bu dalga boyu, ancak, tam olarak iki fotonlu photolysis PA-NIC5kaçınamazlar. Alexa Fluor 488 PA-NIC banyo-uygulama deneylerde avantajlıdır; uygun dalga boyu ≥900 nm ile heyecanlı zaman iki fotonlu photolysis PA-NIC5 hala hücresel kompartmanlarda uygun görselleştirme koruyarak önlenebilir. Şekil 4 Beyin dilimleri nöronlarda MHb yerelleştirilmiş PA-NIC lazer flash photolysis için örnek verileri gösterir. Şekil 4a bir ekran yakalama ile belgili tanımlık fotoğraf-stimülasyon spot yer paylaşımlı MarkPoints Protokolü çalıştırılmadan önce çekilen son 2PLSM görüntünün bir “referans” görüntü örneği (üst panelleri) gösterir. Şekil 4a (alt resim panelleri) hücresel morfoloji overlaid fotoğraf stimülasyon yakınlaştırılmış bir görünümünü spot gösterir. PA-Nic photolysis için karşılık gelen ilişkili süre elektrofizyolojik yanıt Şekil 4aalt panelleri gösterilir. Önceki çalışma bu akımlar nAChR antagonistleri5′ e duyarlı olduğunu göstermiştir. Şekil 4b gösterir nerede tek nokta photolysis ya 1 bir aralıkta yapılır farklı hücrelerden temsilcisi veri s veya 10 s. 10 s aralığı verilen geçerli tutan temel yeterli kurtarma süre ise, daha kısa bir 1 s aralığı yol açtı bir holding iletişim kuralı olarak geçerli dereceli artışı devam etti. Geçerli artan nikotin sistemi 1 Hz aralığı29ile diffüz için yeterli zaman sahip olmadığını gösteriyor. NAChRs neuropharmacology hücre tipleri arasında farklı olabilir olarak zamansal böyle tepki analizleri olmalıdır okudu, herhangi bir yeni hücre tipi de novo gerçekleştirilen. Şekil 1: Photostimulation lazer kalibrasyon. (bir) fotoğraf-uyarılması lazer güç çıkışı. Örnek uçak güç (60 x aracılığıyla / 1.0 NA su daldırma amaç) 405 için ölçüldü nm ve 473 nm fotoğraf-stimülasyon lazerler, belirtilen çıkış ayarında. (b) fotoğraf-uyarılması lazer kalibrasyon. Ekran yakalama görüntüleri göstermek amaçlanan fotoğraf-stimülasyon nokta ve fotoğraf-stimülasyon (sol) önce (yanık delikli) oluştuğu ilgili alana kayma ilişkisi ve sonra (sağda) çalışan ayarı’nda MarkPoints. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: PA-NIC yerel uygulama. (bir) algılama PA-NIC üzerinden bir yerel uygulama pipet. 1 mM PA-NIC, photolysis yan ürün veya nikotin ACSF içinde çözünmüş, bir yerel uygulama pipet yüklenen ve beyin dokusu 2PLSM sırasında reçete (900 nm uyarma) her ilaç için aynı görüntüleme ayarları kullanarak görüntüleme. Devresel_ödeme GaAsP katot floresan emisyon yakalamak için kullanıldı ise lazer Dodt kontrast iletim resmi taramak doku/pipet gösterir. (b) PA-NIC (1 mM) beyin dokusu içine derin ve PA-NIC kendi içsel floresans kullanarak yanal yayılmasını göstermek için yolu ile olduğu gibi (bir) 2PLSM görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: 2-foton lazer mikroskobu görüntüleri taramak edinimi. (bir) en iyi 2PLSM Z-yığınlar. İki 2PLSM Z-yığın maksimum yoğunluk projeksiyon iyi çözülmüş dendrites ile MHb nöronlar için gösterilen ve biraz daha müdahaleci enkaz örnekleridir. (b) alt-optimal 2PLSM Z-yığınlar. İki 2PLSM Z-yığın maksimum yoğunluk projeksiyon örnekleri enkaz (hücre yaklaşım sırasında pipet ihraç boya) çevrili MHb nöronlar için gösterilir. Böyle görüntüleri görüntüler (bir) gösterilenlerle gibi daha yorumlamak daha zordur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: lazer flash photolysis PA-NIC, (bir) MarkPoints referans görüntüler ve içe akımları PA-Nic photolysis tarafından uyarılmış. Bir MHb neuron için ham referans fotoğraf MarkPoints fotoğraf-stimülasyon denemeler bir tek (gösterilen) hücresel yeri için gösterilir. Bazı fotoğraf-stimülasyon konumları (Bu serinin en sağdaki resimde), odakta dendritik yapıdır fakat soma ve proksimal dendrite değildir unutmayın. Her başvuru görüntünün altında nikotin uncaging uyarılmış içe geçerli çizilir. (b) arası uyarıcı aralıkları için PA-Nic photolysis. Suret kayıtları nerede nikotin aynı perisomatic konumda 1 arası uyarıcı aralığı ile Art arda kokulum MHb nöronlar için gösterilir s veya 10 s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

PA-NIC uygulama/Teslimat yöntemi bu yerelleştirilmiş fotoğraf-stimülasyon tekniği en kritik adımda seçimdir. İki yöntem, banyo uygulama ve yerel perfüzyon, her teklif farklı avantajlar ve sınırlamalar. Seçim ilgi hücre tipi nAChR fonksiyonel ifade kademede tarafından büyük ölçüde etkilenir. Sık sık banyo uygulama verileri yorumlama kolaylaştırmak kaydedilen hücre çevreleyen bir üniforma sonda konsantrasyon için izin verdiği fonksiyonel ifade düzeyleri yüksek, ne zaman banyo uygulamayı kullanmak için tercih edilir. Banyo uygulama aynı zamanda ikinci bir perfüzyon pipet dokusunda tüm süreci daha kolay yapma gereksinimini ortadan kaldırır. Ancak, banyo uygulanması pahalı maliyeti daha fazla deney başına bileşikleri.

Genellikle, sorun giderme Hayır nAChR harekete geçirmek görülen aşağıdaki flash photolysis neden olduğunu anlamaya çalışan içerir. PA-NIC ile daha önce araştırılmamıştır bir hücre tipi ile çalışırken, araştırmacı ACH yerel puf-uygulama yapmak gerekir veya nikotin yeterli reseptörleri işlevsel olup olmadığını belirlemek için5dile getirdi. Sistem photolysis yanıt algılama kapasitesine sahip olduğunu doğrulamak için denetim deneyler reseptör30büyük miktarlarda hızlı medial habenula nöronlarda yapılmalıdır. Bu beyin alanında PA-NIC banyo uygulama hangi doğrulama denemeleri için tercih edilir, mümkündür. Sadece bu doğrulama deneyler gerçekleştirdikten sonra bir bir doğaçlama hücre tipine devam etmeliyiz. Eğer deneysel sistem doğrulandı ve çok küçük veya belirlenemeyen yanıt kalır, bu garanti kapsamında PA-NIC konsantrasyonu artırmak, flash yoğunluğu veya darbe süresi, artırmak için bir nAChR olumlu allosteric modülatör nAChR geliştirmek için eklemek Etkinlik6veya bunların bir kombinasyonu.

Zaman zaman, uncaging yanıt-e doğru çok büyük, kapılı Na+ Kanal harekete geçirmek ve zavallı uzay kelepçe nedeniyle unclamped içe akımları ile dolaylı gerilim kaynaklanan önemli nAChR harekete geçirmek. Tamamen nAChR içe akımları karanlık ve veri yorumu imkansız yapmak, bu eserler, QX-314 (2 mM), kayıt pipet eklenmek üzere ortadan kaldırılabilir. Onlar da PA-NIC konsantrasyonu azaltarak veya flash yoğunluğu veya darbe süresi azaltarak ortadan. Tüm görünür ışık fotoğraf-stimülasyon deneylerde bakım istenmeyen stimülasyon/photolysis istenen odak düzlemi altında veya üstünde önlemek için stimülasyon siteleri seçerken uygulanmalıdır. Ayrıca ve ne zaman uygun lazer güç her zaman fizyolojik yanıt çoğaltmak titre gerekir. Yukarıdakini/aşağıdakini odak nokta aktif ligandlar hala diffüz ve biyolojik sistemi (yani, reseptörleri) altında eğitim ile etkileşim gibi kafesli ligandlar ile çalışırken z ekseni photostimulation haberdar olmak özellikle önemlidir.

Çeşitli sınırlamalar var gibi PA-NIC lazer flash photolysis bütün müfettişler için uygun olmayabilir. İlk nispeten yüksek maliyetli uygun bir tuzak olduğunu. Dendrites gerektirir gibi 2 fotonlu mikroskop gibi sofistike görüntüleme sistemi olduğu gibi beyin dilimlerle çalışırken, küçük çaplı yapıları uncaging. Bir Ti:sapphire, lazer için performans gösteren 2-foton mikroskobu, akort IR yüksek maliyet dışında bağımsız olarak iki lazer ışınları daha fazla konumlandırma özelliğine sahip bir çift-galvanometre sistemi sistem maliyeti artırır. Toplam sistem maliyeti araştırmacı yeterli uzmanlığı ve inşa, sorun giderme ve böyle bir sistemi korumak için zaman varsa bir ev inşa sistemi kullanılarak azaltılabilir. Yukarıda da belirtildiği gibi adımları alarak kısmen azaltılabilir, düşük nAChR fonksiyonel ifade kez ikinci bir sınırlama içerir ancak bu başarı garanti. Eğer bir ligand-harekete geçirmek akımları puf-agonistler uygulanması takip ölçemezsiniz, genellikle, PA-NIC flash photolysis gerilim kıskacı altında kabul edilebilir sonuçlar verebilir değil. Üçüncü bir sınırlama içsel içerir floresans PA-NIC PA-NIC ~ 405 nm ışık emer ve yeşil flüoresan protein (GFP) veya Alexa 4885benzer bir aralıkta yayar. PA-NIC konsantrasyonları ~ 1 mM aştığında, bu floresans özellik aynı anda nöronal yapıları görselleştirmek için zorlu yapabilirsiniz. Bu etkisini azaltmak için kolayca PA-NIC akışından perfüzyon pipet kontrol edebilmek için önemlidir. Periyodik olarak, PA-NIC akışı uzak diffüz floresan moleküllerin izin vermek için durduruldu. Bu nöron uncaging ışını spot konumunu kontrol etmek için yeniden görüntüleme izin. Dördüncü bir potansiyel sınırlama söz 405 nm ışık kullanımı için photolysis içerir. 405 gibi daha kısa dalga boyları nm saçılma için daha fazla eğilimli bir beyin dilim gibi karmaşık bir doku. Böylece, bir verilen flash şiddeti ve süresi, uncaging yanıt genlikleri ve çürüme kinetik differentially dilimi içinde uncaging odak derinliği tarafından etkilenebilir. NAChRs hakkında biyolojik açıdan sonuçları bu önemli uyarı dikkate almak zorundayım.

Bu yerelleştirilmiş lazer flash photolysis teknik nAChR Nörobiyoloji ilgili yeni ayrıntıları ortaya çıkarmak için son zamanlarda kullanılmış. Örneğin, kronik nikotin pozlama perisomatic ve medial habenula nöronlar5dendritik nAChR işlevinde geliştirir. Ayrıca, ilk kez, ventral tegmental alan glutamat nöronlar fonksiyonel nAChRs kendi perisomatic ve dendritik hücresel kompartmanlarda6hızlı göstermeye yardımcı olmak için kullanıldı. Orada birçok potansiyel gelecek bu tekniği kullanır ve yaklaşım striatum33 kortikal piramidal nöronların31 veya serebral korteks32, interneurons gibi hızlı nAChRs bilinen diğer anahtar nöron türlerine uygulanabilir ve hipokampus19. Bu teknik aynı zamanda Farmakoloji ve/veya nAChR gen belirli reseptör alt türlerinden farklı nöronal bölmeleri için yerelleştirmek için34 düzenleme ile birlikte. Yaklaşım dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, bu PA-NIC5ile paralel olarak geliştirilen diğer coumarin kafesli bileşikler kolayca adapte olabilir. Son olarak, PA-NIC flash photolysis bir gün uyanık/davranıyor hayvan roman davranış Farmakoloji paradigmalar nikotin eylem eğitim için kullanılabilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laboratuvar üyeleri aşağıdaki Kuzeybatı asıl araştırmacılar, yazarlar teşekkür: Ryan Drenan, ö. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy ve ANIS müteahhit. Bu eser bize ulusal kurumları sağlık (NIH) (hibe DA035942 ve DA040626 R.M.D. için), ilaç Vakfı (arkadaşlık M.C.A. için) ve HHMI tarafından desteklenmiştir.

Materials

Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals
Multiclamp 700B Molecular Devices Corp. Patch clamp amplifier
Pneumatic Picopump World Precision Instruments PV820
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97
Temperature Controller Warner Instruments TC-324C
Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1200S
Ultrafree-MC Centrifugal Filter MilliporeSigma UFC30GV0S internal solution filter
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B150F-4 patch and local application pipette
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt Glentham GL9693 nicotine salt
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin Janelia Research Campus PA-Nic by-product
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine Janelia Research Campus PA-Nic
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) Virbac ANADA #200-071
Alexa FluorTM 488 Hydrazide ThermoFisher A10436 green fill dye
Alexa FluorTM 568 Hydrazide ThermoFisher A10437 red fill dye
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) Janelia Research Campus red fill dye
QX 314 chloride Tocris 2313 voltage-gated sodium channel blocker
Power Meter  ThorLabs S120C
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Solutions
N-Methyl-D-glucamine Sigma M2004
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium bicarbonate Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
D-(+)-Glucose Sigma G5767
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A4034
Thiourea Sigma T8656
Sodium pyruvate Sigma P2256
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma 223506
Sodium chloride Sigma S9625
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma E3889
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
Name Company Catalog Number Comments
Components of 2-Photon Microscope
 Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope Bruker Nano, Inc. imaging software and galvos
    Imaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Mai Tai HP1040 Spectra-Physics Tuneable IR laser
            Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver Conoptics, Inc. for IR laser attenuation
                Integrating Sphere Photodiode Power Sensor Thorlabs, Inc laser power pick-off photodiode
    Uncaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Helios 2-Line Laser Launch Bruker Nano, Inc. uncaging laser components
            OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) Coherent, Inc.
            OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) Coherent, Inc.
            Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging Bruker Nano, Inc.
Name Company Catalog Number Comments
Upright Microscope  Olympus BX51WIF Upright microscope chasis
    Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm  Olympus 10x objective
    Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR  Olympus 60x water-dipping objective
    X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source Excelitas Technologies LED Light Source
        Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for blue light excitation
        Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for green light excitation
    B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD Watec Co., LTD. CCD camera for patch clamp recording
Name Company Catalog Number Comments
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 red channel PMT
        595/50m Chroma Technologies red channel emission filter
            565lpxr Chroma Technologies dichroic beam splitter
    GaAsP end-on PMT Hamamatsu 7422PA-40 green channel PMT
        525/70m Chroma Technologies green channel emission filter
            High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT Vincent Associates / Bruker 517329 PMT shutter mount
Name Company Catalog Number Comments
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 Dodt PMT
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
  2. Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
  3. Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer’s disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
  4. Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
  5. Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
  6. Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
  7. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
  8. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  9. Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
  10. Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
  11. Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
  12. Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
  13. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neurociencias. 218, 1-11 (2012).
  14. Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
  15. Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
  16. Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
  17. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
  18. Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
  19. Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
  20. Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
  21. Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
  22. Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
  23. Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
  24. Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
  25. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
  26. Inoue, S., Spring, K. . Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
  29. Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
  30. Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
  31. Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
  32. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  33. Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
  34. Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).

Tags

Laser Flash PhotolysisPhotoactivatable NicotineNicotinic Acetylcholine ReceptorsMouse Brain SlicesMulti-photon Laser-scanning MicroscopySpatiotemporal ControlCholinergic Synaptic TransmissionVolume TransmissionPatch ClampPressure EjectionBath ApplicationPerfusion System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Arvin, M. C., Wokosin, D. L., Banala, S., Lavis, L. D., Drenan, R. M. Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine. J. Vis. Exp. (143), e58873, doi:10.3791/58873 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image