Wir stellen einen neuartige Workflow für Elektronenmikroskopie Untersuchungen von Hirngewebe. Die Methode ermöglicht dem Benutzer, neuronale Funktionen auf unvoreingenommene Weise zu prüfen. Für die Elementaranalyse präsentieren wir auch eine Skript, die meisten des Workflows für randomisierte Stichprobe automatizes.
Untersuchungen der Ultrastrukturforschung Funktionen von Neuronen und ihre Synapsen sind nur möglich mit Elektronenmikroskopie. Vor allem für vergleichende Studien über die Änderungen in den dichten und Distributionen solcher Merkmale unbedingt eine unvoreingenommene Probenahme-Protokoll für zuverlässige Ergebnisse. Hier präsentieren wir Ihnen einen Workflow für die Bildaufnahme Gehirn Proben. Der Workflow ermöglicht einheitliche systematische Stichproben innerhalb einer definierten Gehirnregion, und die Bilder können mit einem Disector analysiert werden. Diese Technik ist wesentlich schneller als umfangreiche Prüfung der Schnittserien aber noch einen Machbaren Ansatz zur Abschätzung der dichten und Verteilungen der Ultrastruktur Features präsentiert. Vor dem Einbetten, wurden gefärbten Vibratome Abschnitte als Referenz verwendet, um die Region des Gehirns untersucht, welche geholfen beschleunigen den gesamten Probenvorbereitung verarbeiten zu identifizieren. Dieser Ansatz war für vergleichende Studien untersuchen die Wirkung der Naturbedingungen bereichert-Gehäuse auf mehrere Ultrastrukturforschung Parameter in das Gehirn der Maus verwendet. Basierend auf den erfolgreichen Einsatz des Workflows, wir es zum Zwecke der Elementaranalyse Gehirn Proben angepasst. Wir optimieren das Protokoll in Bezug auf die Zeit der Benutzer-Interaktion. Automatisieren die zeitaufwändigen Schritte durch die Erstellung eines Skripts für die open-Source-Software SerialEM hilft dem Anwender, konzentrieren sich auf das Hauptwerk der elementaren Karten zu erwerben. Wie in der ursprünglichen Workflow wir geachtet, die unvoreingenommene Stichprobenansatz um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren.
In der Elektronenmikroskopie ist es oft schwierig, repräsentative Regionen innerhalb der Abschnitte zu probieren. Wir sind als Beobachter oft voreingenommen, zu betrachten, bestimmte Regionen von Auffälligkeiten der Probe, um unsere Aufmerksamkeit gezogen verhindert eine gut verteilte, unvoreingenommene Auswahl. Sampling Bias kann nur vermieden werden, wenn jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance, in ein Elektron Mikrograph1enden wird. Es ist möglich, Probenahme Verzerrungen ohne eine Software-Lösung, z. B. zu vermeiden, indem man den Trackball des Mikroskops manuell ohne Blick auf das Bild, um die Sample-Bereiche auswählen, wo die Etappe beendet. Aber dies ist streng genommen keine zufällige Verfahren, da bewusst oder unbewusst, der Benutzer kann einen Einfluss auf die Bewegung der Bühne haben, und darüber hinaus dies keine anspruchsvolle Art ist der Auswahl von Sample-Bereiche. Stichproben wird besonders wichtig, wenn Paare von Abschnitten verwendet werden, um die Anzahl der Strukturen in einem bestimmten Volumen, z. B. für Stereologie1, bewerten die Paare von Abschnitten, einem bekannten Abstand erfordert. Es wäre auch möglich, nur einen einzigen Abschnitt betrachten und schätzen die Zahl der spezifischen Strukturen2, aber mit diesem Ansatz Ermittler tendenziell überschätzen die numerische Dichte der größeren Strukturen, es sei denn, die Strukturen sehr klein sind im Vergleich zu der Schnittdicke. Alternative Ansätze sind Mengen von Gewebe aus Schnittserien zu rekonstruieren und somit erhalten die gewünschten Daten3. Aber das ist sehr zeitaufwändig und keinen Machbaren Ansatz für (größere) vergleichende Studien.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen Workflow entwickelt, mit dem die Forscher Proben für den Erhalt der Elektron Mikrographen in regelmäßigen Abständen innerhalb von ultra-dünnen Abschnitten automatisch auswählen können. Die Position des Elektrons Mikrographen ist zufällig, so dass unvoreingenommene Probenahme. Das Konzept eignet sich sowohl zur Bestimmung der numerischen dichten Strukturen (z. B. Synapsen innerhalb einer bestimmten Neuropil Band4,5) und die Abmessungen der strukturellen Merkmale (z. B. die Breite der synaptischen Spalt oder den Durchmesser der postsynaptischen Dichte4,5).
Der Workflow verwendet eine maßgeschneiderte Zufallspunkt Probenahme (RPS) Software (geschrieben in Java-Script mit Scripting-Software im Lieferumfang unser Mikroskop), die Startplätze innerhalb eines vordefinierten Bereichs von Interesse in einem ultra-dünnen Abschnitt automatisch berechnet. Die RPS-Software verschiebt die Bühne des Elektronenmikroskops an diese vordefinierten Punkten, sodass ein Elektron Schliffbild an jeder Stelle erfolgen kann. Zunächst definiert der Benutzer eine Region of Interest innerhalb der Dünnschliff. Als nächstes berechnet die RPS-Software Startplätze innerhalb dieser Region. Die X / y-Koordinaten der ersten Position werden nach dem Zufallsprinzip erstellt, und die restlichen Positionen werden in regelmäßigen Raster Abständen in Bezug auf die erste Position platziert. Da jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance geprüft wird hat, können minimale Datenerhebung. Dieser Ansatz der Probenahme nennt man auch systematische einheitliche Stichproben (siehe Referenzen6,7 für weitere Details).
Für die Ermittlung der numerischen dichten Strukturen, arbeiten wir mit Paaren aus Abschnitten, die einem bekannten Abstand voneinander entfernt sind. Bewegt sich nach Erhalt eines Elektrons Schliffbild aus dem ersten Abschnitt in eine der vorgegebenen Positionen, TEM serielle Abschnitt Software (Teil des Softwarepakets unser Elektronenmikroskop im Lieferumfang) auf den entsprechenden Punkt im zweiten Abschnitt, um erhalten Sie ein Elektron Schliffbild des entsprechenden Standortes. Dies wird für jeden Standort im vorgegebenen Raster wiederholt. In unserem Ansatz wird ein Disector verwendet, um die Anzahl der Partikel in jedem Paar von Elektronen Mikrographen8,9. Ein Disector besteht aus einem Paar von zählen der Frames, eine für jeden Abschnitt8,9. Die numerische Dichte Objekte richtet sich nach nur zählen von Objekten sichtbar auf dem ersten Abschnitt (oder Referenz) aber nicht auf den zweiten Abschnitt (oder Lookup). Dies ermöglicht, um die numerischen dichten von Objekten in einer schnellen und effizienten Weg8,9zu schätzen. Zusätzlich können einzelne Abschnitte, zweidimensionalen strukturellen Merkmale gemessen werden.
Wir haben diesen Workflow erfolgreich um Unterschiede in der Synapse Zahlen im Hippocampus von Mäusen angereicherten Umgebung (EE) Wohnverhältnisse verglichen mit Standardumgebung (SE) Gehäuse Bedingungen4,5ausgesetzt bewerten angewendet, und auch die Ultrastrukturforschung Unterschiede zwischen Wildtyp (WT) Mäuse und Neuropeptid Y (NPY) KO-Mäusen unter SE und EE5gehalten zu bewerten. Unser Ziel war es, speziell Strukturmerkmale von Neuronen, wie die numerische synaptische Dichte, die Längen von der aktiven Zone in Querschnitten und der postsynaptischen Dichte, die Breite der synaptischen Spalt und die Anzahl der synaptischen Vesikel betrachten, um Änderungen in neuronale Konnektivität und Aktivierung zwischen den verschiedenen experimentellen Bedingungen zu beurteilen. Darüber hinaus waren wir interessiert die numerische Dichte von dichten Kern Vesikeln (DCV) in den Neuronen, die Menge des gespeicherten Neuropeptide in einem bestimmten Bereich des Gehirns bestimmen.
Basierend auf dem Erfolg unseres Ansatzes für die Studien beschriebenen, in unseren nächsten Schritt haben wir unseren Workflow markieren Sie Bereiche für unvoreingenommene elementare Analysen im menschlichen Gehirn Proben angepasst. Dies geschah zu Bild Eisen in Ferritin-Moleküle in Neuronen und Gliazellen gespeichert. Hierzu haben wir eine Skript, das uns erlaubt, die meisten Operationen für eine zufällige Screening-Prozess des Gehirns Abschnitte in einem definierten Bereich zu automatisieren.
Die hier vorgestellten Workflow ermöglicht den Forscher zum Abrufen von Daten auf Ultrastrukturforschung Funktionen auf unvoreingenommene Weise. Dies ist viel weniger Zeit in Anspruch als Volumen Untersuchungen von Schnittserien. Mehrere Anwendungen werden verwendet, um dieses Ziel zu erreichen. Zunächst wird unsere maßgeschneiderte RPS -Software (für Informationen über Verfügbarkeit, kontaktieren Sie bitte den entsprechenden Autor) verwendet, um einzuführen, eine zufällige Bühne-Schicht um die Probenahme Bereich Koordinaten auszuwählen. Dies ermöglicht eine einheitliche systematische Stichproben des ROI. Als nächstes für die Zählung der spezifischen Strukturen angepasst wir die Disector-Methode, wo 2 aufeinanderfolgende Abschnitte mit bekannten Abstand verglichen werden, in neuartiger Weise im Vergleich zu früheren Studien13,14,15 , wie wir es gewohnt unsere maßgeschneiderte RPS-Software für systematische einheitliche Stichproben. Das spart Zeit im Vergleich zu 3D Rekonstruktion ganze Bände von Schnittserien. Die maßgeschneiderte RPS-Software ist speziell für eine Art von Mikroskop entwickelt, die ein limitierender Faktor für die Reproduktion des Workflows ist. Eine Alternative von dieser speziellen Software wäre eine Anwendung, die erlaubt, scripting und ist kompatibel mit anderen Mikroskop-Modellen.
Wir verwendet erfolgreich diesen Ansatz für unsere Vergleichsstudien4,5. Auf ultra-dünnen Abschnitten des neuronalen Gewebes Interessenbereich wurde skizziert und Bilder wurden durch systematische einheitliche Stichproben innerhalb dieses Bereichs. Es muss darauf hingewiesen werden, dass das Gebiet von Interesse, die polymorphen Schicht der dentate Gyrus, ist ein eher kleines Gebiet zu untersuchen, die für unser Ansatz von Vorteil sein könnte. Innerhalb einer zufällig platzierte Disector wir untersuchten die Anzahl der DCV und mehrere Ultrastrukturforschung Merkmale der Synapsen in der DGpl des Erwachsenen Mäusen in SE und EE sowie Erwachsenen WT Mäuse im Vergleich zu Erwachsenen NPY-Knockout-Mäusen untergebracht. Mit unserem Ansatz, die gesammelten Daten zeigten Veränderungen in einigen der untersuchten Parameter. Diese Feststellungen bestätigt diejenigen aus anderen ähnlichen Studien in juvenile Tiere2.
Ein Nachteil der experimentellen Nutzung dieser Workflow könnte sein, dass diese multi-application-Ansatz nicht im Hinblick auf Benutzerfreundlichkeit, ideal ist, da die Benutzer benötigen, um sich bequem mit verschiedenen Benutzeroberflächen (in unserem Fall, das User-Interface, TEM serielle Abschnitt die RPS und SerialEM Software). Lernen, alle Anwendungen auf effiziente Weise zu behandeln ist zeitaufwendig und sollte Rechnung getragen werden. Allerdings ist investieren die Zeit in das Erlernen dieser Workflow verwenden noch deutlich günstiger im Laufe der Zeit die benötigt wird, um ganze Bände mit seriellen Abschnitt TEM zu analysieren. Die Methode der Verwendung eines Disector durch systematische einheitliche Stichproben in den gewünschten Bereich platziert ist ausreichend, um zuverlässige Daten1 ohne die Notwendigkeit, ein hohes Maß an Abschnitte/Volumen untersuchen zu präsentieren.
Um die Ergebnisse unserer Studien zu maximieren, war es wichtig, während der Probenvorbereitung, gut aufpassen, wie die Erhaltung der Gewebe und Strukturen nicht nur entscheidend für die Bewertung der strukturellen Merkmale, sondern auch für den Bereich eindeutig zu identifizieren. Ein entscheidender Faktor, und vielleicht ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass eine hohe Qualität der ultra-dünne Abschnitte Paare erforderlich ist: Es darf keine Löcher oder Falten, die das Untersuchungsgebiet aus den Abschnitten zu decken und die Schnittdicke muss sein homogene gepflegt. Der Forscher muss gut ausgebildete in ultramicrotomy sein. Pflege muss auch getroffen werden, wenn die Abschnitte in der TEM, imaging, wie in den Abschnitten empfindlich gegenüber Elektronen Strahl Schaden sind und können leicht zerreißen. Darüber hinaus ist es wichtig, die richtige Anzahl von Stichproben Bereiche in den ROI zu wählen. Abhängig von den experimentellen Ziel muss die Vergrößerung des Elektrons Mikrographen sorgfältig eingestellt werden. Für unsere Experimente sind insbesondere zählen Synapsen im Zentralnervensystem, 20 Regionen von Interesse in einem Abschnitt mit einer Fläche von 30.25 µm2 optimal. Es wird empfohlen, das Personal gut in die Funktionen in Frage (in unserem Fall Synapsen, synaptischen Funktionen und DCV) zu erkennen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Um die Synapsen zu identifizieren, die synaptischen Vesikel müssen erkennbar sein und dies erfordert eine Auflösung von mindestens 10 nm. Hierzu eine Vergrößerung von 5000 X war optimal, aber es muss darauf hingewiesen werden, dass die Vergrößerung abhängig von Hardware-Parameter wie die Art und Position der Kameras und für andere Mikroskop und/oder Kamera-Typen angepasst werden müssten. Es muss auch darauf hingewiesen, dass das Protokoll Anwendungen spezifisch für eine TEM verwendet und Benutzer mit anderen Modellen die Unterschiede in der Einrichtung zu berücksichtigen müssen.
Wir glauben, dass unser Workflow angepasst werden kann für viele andere Anwendungen, die nicht nur in den Neurowissenschaften, sondern in einem breiten Feld von Biologie und Materialwissenschaften (wenn die hohe Auflösung von einem TEM benötigt wird) wenn die Forschungsfrage eine systematische Uniform erfordert Stichproben und die Menge der zu untersuchenden Proben bittet um eine Zeit effiziente Methode zur Analyse. Zum Beispiel sind wir derzeit interessiert bei der Lokalisierung von Eisenspeicher im menschlichen Gehirn. Hierzu haben wir vor kurzem unseren Workflow, um elementare Analyse auf ultra-dünnen Abschnitten in zufällig ausgewählten Bereichen ermöglichen angepasst. Um die Anzahl der Anwendungen zu minimieren, die für den Workflow benötigt werden, hatten wir vor, bewerben Sie sich über die SerialEM Software nur, weil es programmiert werden kann, verschieben Sie die Phase Punkte vorzugeben, die in einer zufälligen ausgewählt werden können. Wir erstellt benutzerdefinierte Skripts zur Steuerung der TEM, mit dem Ziel, den Workflow vollständig automatisieren. Dies erwies sich als machbar, mit Ausnahme der Autofokus im gefilterten bildgebenden Modus, der nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Wir nutzten so DM Software für die Fokussierung und für den Erhalt der Energie-gefilterte Bilder.
Zusammenfassend stellen wir Software-Lösungen, die helfen bei der Beschaffung von Elektron Mikrographen auf unvoreingenommene Weise.
The authors have nothing to disclose.
Gefördert durch den Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF, Projektnummer P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |