Introduciamo un romanzo del flusso di lavoro per le indagini di microscopia elettronica del tessuto cerebrale. Il metodo consente all’utente di esaminare le caratteristiche di un neurone in modo imparziale. Per analisi elementare, presentiamo anche uno script che automatizza la maggior parte del flusso di lavoro per il campionamento randomizzato.
Le indagini delle caratteristiche ultrastrutturali dei neuroni e le sinapsi sono possibili solo con microscopia elettronica. Soprattutto per gli studi comparativi dei cambiamenti nella densità e distribuzioni di tali caratteristiche, un protocollo di campionamento imparziale è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l’acquisizione di immagini di campioni del cervello. Il flusso di lavoro consente di sistematici di campionamento casuali uniformi all’interno di una regione definita del cervello, e le immagini possono essere analizzate usando un disector. Questa tecnica è molto più veloce di un esame approfondito delle sezioni di serie ma ancora presenta un approccio fattibile per stimare la densità e le distribuzioni delle caratteristiche ultrastruttura. Prima di incorporare, macchiato vibratome sezioni sono state usate come riferimento per identificare la regione del cervello sotto inchiesta, che ha contribuito a velocizzare la preparazione del campione globale di processo. Questo approccio è stato utilizzato per studi comparativi che studia l’effetto di un ambiente arricchito-alloggiamento su parecchi parametri ultrastrutturali nel cervello del topo. Basato sul riuscito uso del flusso di lavoro, abbiamo adattato ai fini dell’analisi elementare dei campioni del cervello. Abbiamo ottimizzato il protocollo in termini di tempo di interazione dell’utente. Automatizzare tutti i passaggi che richiede tempo di compilazione di uno script per il software open source SerialEM aiuta l’utente a concentrarsi sul lavoro principale di acquisire le mappe elementali. Come il flusso di lavoro originale, abbiamo prestato attenzione all’approccio imparziale campionamento per garantire risultati affidabili.
In microscopia elettronica, spesso risulta difficile a campione rappresentative regioni all’interno delle sezioni. Ci, come osservatore, sono spesso distorte a guardare la pagina di specifiche regioni disegnate alla nostra attenzione da cospicue caratteristiche del campione, impedendo un campionamento ben distribuito, imparziale. Bias di campionamento può essere evitato solo se ogni parte della regione di interesse ottiene la stessa probabilità di finire in un Micrografo elettronico1. È possibile evitare bias di campionamento senza una soluzione software, ad esempio, premendo la trackball del microscopio manualmente senza guardare l’immagine, in modo da selezionare le regioni di campionamento ovunque la fase si arresta. Ma non si tratta propriamente di una procedura casuale, perché, consciamente o inconsciamente, l’utente può avere un’influenza sul movimento del palco, e, inoltre, questo non è un modo sofisticato di selezionare le regioni di campionamento. Campionamento casuale diventa particolarmente importante se vengono utilizzate coppie di sezioni per valutare il numero di strutture in un certo volume, ad esempio, per stereology1, che richiede coppie di sezioni, una distanza nota apart. Sarebbe anche possibile guardare solo a una singola sezione e stimare il numero di strutture specifiche2, ma con questo approccio gli investigatori tendono a sovrastimare la densità numerica di strutture più grandi, a meno che le strutture sono molto piccole in confronto allo spessore della sezione. Approcci alternativi sono a ricostruire volumi di tessuto da sezioni di serie e quindi ottenere i dati desiderati3. Questo però richiede molto tempo e non un approccio fattibile per studi comparativi (più grandi).
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro che consente al ricercatore di selezionare automaticamente i campioni per ottenere i micrografi elettronici a spaziatura regolare all’interno delle sezioni ultrasottili. La posizione dei micrografi elettronici è casuale, permettendo di campionamento imparziale. L’approccio è adatto sia per determinazione densità numerica di strutture (ad esempio, sinapsi all’interno di un certo neuropil volume4,5) e le dimensioni delle caratteristiche strutturali (ad esempio, la larghezza della fessura sinaptica, o il diametro delle densità postsinaptica4,5).
Il flusso di lavoro utilizza un punto casuale su misura (RPS) software (scritto in Java script utilizzando script software fornito con il nostro microscopio) che calcola automaticamente le posizioni in griglia all’interno di una zona predefinita di interesse in una sezione ultrasottile di campionamento. Il software RPS si muove la fase del microscopio elettronico questi punti predefiniti, affinché un Micrografo elettronico può essere fatta in ogni punto. In primo luogo, l’utente definisce un’area di interesse all’interno della sezione sottile. Successivamente, il software RPS calcola posizioni in griglia all’interno di questa regione. X / y coordinate della prima posizione vengono create in modo casuale, e le restanti posizioni sono collocate a intervalli regolari griglia rispetto alla prima posizione. Perché ogni parte della regione di interesse ha la stessa probabilità di essere esaminati, questo consente la raccolta minima dei dati. Questo approccio di campionamento viene anche chiamato sistematici di campionamento casuali uniformi (vedi riferimenti6,7 per maggiori dettagli).
Per determinare la densità numerica delle strutture, lavoriamo con coppie di sezioni che sono una distanza conosciuta. Dopo aver ottenuto un Micrografo elettronico della prima sezione in una delle posizioni predeterminate, TEM seriale sezione software (parte del pacchetto software fornito con il nostro microscopio elettronico) si muove il punto corrispondente nella seconda sezione, al fine di ottenere un Micrografo elettronico di posizione corrispondente. Questo si ripete per ogni posizione nella griglia predeterminata. Nel nostro approccio, un disector è usato per contare il numero di particelle in ogni coppia di micrografi elettronici8,9. Un disector è costituito da una coppia di conteggio frame, uno per ogni sezione8,9. La densità numerica degli oggetti è determinata contando solo gli oggetti visibili sulla prima sezione (o sezione di riferimento), ma non sulla seconda sezione (o sezione ricerca). Questo permette di valutare la densità numerica degli oggetti in un modo rapido ed efficiente8,9. Inoltre sulle singole sezioni, caratteristiche strutturali bidimensionale possono essere misurate.
Abbiamo applicato questo flusso di lavoro con successo per valutare le differenze nel numero di sinapsi nell’ippocampo di topi esposti ad ambiente arricchito (EE) rispetto al ambiente standard (SE) alloggiamento condizioni4,5, condizioni abitative e anche per valutare le differenze ultrastrutturali tra topi wild type (WT) e il neuropeptide Y (NPY) KO topi tenuti sotto SE ed EE5. Il nostro obiettivo era di guardare specificamente alle caratteristiche strutturali dei neuroni, come ad esempio la densità sinaptica numerica, le lunghezze della zona attiva in sezioni trasversali e di densità postsinaptica, la larghezza della fessura sinaptica e il numero di vescicole sinaptiche, al fine di valutare i cambiamenti nella connettività di un neurone e attivazione tra diverse condizioni sperimentali. Inoltre, eravamo interessati alla densità numerica delle vescicole denso-centro (DCV) nei neuroni per determinare la quantità di neuropeptidi stored in una certa area del cervello.
Sulla base del successo del nostro approccio per gli studi descritti sopra, nel nostro prossimo passo, abbiamo adattato il nostro flusso di lavoro per selezionare aree per imparziale analisi elementale all’interno di campioni di cervello umano. Questo è stato fatto a immagine di ferro, che viene memorizzato in molecole di ferritina in sia i neuroni e cellule gliali. Per questo, abbiamo compilato un script che ci ha permesso di automatizzare la maggior parte delle operazioni per un processo di selezione casuale delle sezioni di cervello in un’area definita.
Il flusso di lavoro qui presentato consente al ricercatore di ottenere dati sulle caratteristiche ultrastrutturali in modo imparziale. Questo è molto meno tempo rispetto a indagini di volume da sezioni di serie. Varie applicazioni vengono utilizzate per raggiungere questo obiettivo. In un primo momento, il nostro software su misura di RPS (per dettagli sulla disponibilità, contattare l’autore corrispondente) viene utilizzato per introdurre una fase casuale-MAIUSC per selezionare le coordinate dell’area di campionamento. Questo consente un campionamento casuale uniforme sistematico del ROI. Successivamente, per il conteggio delle strutture specifiche, abbiamo adattato il metodo di disector, dove vengono confrontati 2 sezioni consecutive con distanza nota, in modo inedito rispetto a precedenti studi13,14,15 , come abbiamo usato il nostro software su misura di RPS per campionamento casuale uniforme sistematico. Ciò consente di risparmiare tempo rispetto a 3D-ricostruire interi volumi da sezioni di serie. Il software su misura di RPS è progettato appositamente per un tipo di microscopio, che è un fattore limitante per la riproduzione del flusso di lavoro. Un’alternativa da questo software specifico sarebbe un’applicazione che permette la creazione di script ed è compatibile con altri modelli di microscopio.
Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per i nostri studi comparativi4,5. Ultra-sottili sezioni di tessuto neuronale, l’area di interesse è stata delineata e immagini sono state scattate da sistematici di campionamento casuali uniformi all’interno dell’area. Deve essere notato che l’area di interesse, lo strato polimorfo della circonvoluzione dentata, è una zona piuttosto piccola per indagare che potrebbe essere utile per il nostro approccio. All’interno di un disector posizionati in modo casuale, abbiamo valutato il numero di DCV e diverse caratteristiche ultrastrutturali delle sinapsi in DGpl di topi adulti ospitato in SE ed EE nonché adulto WT topi contro adulti topi knockout NPY. Utilizzando il nostro approccio, i dati raccolti hanno mostrato i cambiamenti in alcuni dei parametri studiati. Questi risultati hanno confermato quelli di altri studi simili in animali giovani2.
Uno svantaggio dell’uso sperimentale di questo flusso di lavoro potrebbe essere che questo approccio multi-applicazione non è l’ideale in termini di facilità d’uso, come gli utenti hanno bisogno ottenere confortevole con diverse interfacce di utente (nel nostro caso, l’interfaccia utente, sezione seriale TEM il software RPS e SerialEM). Imparare a gestire tutte le applicazioni in modo efficiente richiede tempo e dovrebbero essere presi in considerazione. Tuttavia, investendo il tempo ad imparare a utilizzare questo flusso di lavoro è ancora chiaramente favorevole nel corso del tempo che è necessario analizzare interi volumi con sezione di serie TEM. Il metodo di usare un disector posizionato di campionamento casuale uniforme sistematico nella zona di interesse è sufficiente presentare dati affidabili1 senza la necessità di indagare una quantità elevata di sezioni/volume.
Per massimizzare il risultato nei nostri studi, era fondamentale prendersi cura durante la preparazione del campione, come la conservazione del tessuto e le strutture non è solo fondamentale per valutare le caratteristiche strutturali, ma anche per identificare la zona di interesse senza ambiguità. Un fattore fondamentale e forse un altro svantaggio di questo metodo, è che un’alta qualità delle coppie ultra-sottili sezioni è necessario: non ci deve essere nessun fori o rughe che coprono la zona sotto inchiesta in entrambe le parti, e lo spessore di sezione deve essere mantenuta omogenea. Il ricercatore deve essere ben addestrato in ultramicrotomia. Cura deve anche essere presa quando le sezioni in TEM, di imaging, come le sezioni sono sensibili ai danni del fascio di elettroni e possono lacerare facilmente. Inoltre, è importante scegliere il giusto numero di aree di campionamento nel ROI. A seconda l’obiettivo sperimentale, l’ingrandimento dei micrografi elettronici deve essere impostata accuratamente. Per i nostri esperimenti specificamente, contiamo le sinapsi nel sistema nervoso centrale, 20 aree di interesse su una sezione con l’area di 30.25 µm2 sono ottimali. Si consiglia di formare il personale anche nel riconoscere le caratteristiche in questione (nel nostro case sinapsi, funzionalità sinaptica e DCV) per ottenere risultati affidabili. Al fine di identificare le sinapsi, le vescicole sinaptiche devono essere identificabili e ciò richiede una risoluzione di almeno 10 nm. Per questo, un ingrandimento di 5000 X era ottimo, ma deve essere notato che l’ingrandimento dipende da parametri hardware quali il tipo e la posizione delle telecamere e avrebbe bisogno di essere adattato per altri tipi di microscopio e/o videocamera. Ha inoltre deve essere notato che il protocollo utilizza applicazioni specifiche per un TEM e che gli utenti con altri modelli dovranno considerare le differenze nell’impostazione.
Crediamo che il nostro flusso di lavoro può essere adattato per molte altre applicazioni non solo nell’ambito delle neuroscienze, ma in un ampio campo di scienza biologica e anche scienza dei materiali (quando è necessaria l’alta risoluzione di un TEM) ogni volta che la domanda di ricerca richiede una sistematica uniforme campionamento casuale e la quantità di campioni da esaminare chiede un modo efficiente di tempo di analisi. Ad esempio, siamo attualmente interessati nella localizzazione di depositi di ferro nel cervello umano. Per questo, recentemente abbiamo adattato il nostro flusso di lavoro, per consentire analisi elementare sulle sezioni ultrasottili in aree selezionate in modo casuale. Al fine di ridurre al minimo il numero di applicazioni che sono necessari per il flusso di lavoro, abbiamo mirato a applicare utilizzando il software di SerialEM solo, perché può essere programmato per spostare la fase di pre-impostare punti che possono essere selezionati in modo casuale. Abbiamo creato script personalizzati per controllare il TEM, con l’obiettivo di automatizzando il flusso di lavoro interamente. Ciò è risultato fattibile tranne che per la messa a fuoco automatica in modalità di imaging filtrata, che non ha dato risultati soddisfacenti. Abbiamo quindi utilizzato software di DM per messa a fuoco e per ottenere le immagini di energia-filtrata.
In sintesi, vi presentiamo soluzioni software che aiutano ad ottenere i micrografi elettronici in modo imparziale.
The authors have nothing to disclose.
Finanziato per il numero di progetto fondo austriaco di scienza, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |