Nous introduisons un roman “workflow” pour microscopie électronique enquêtes du tissu cérébral. La méthode permet à l’utilisateur d’examiner les fonctions neuronales de façon impartiale. Pour l’analyse élémentaire, nous présentons également un script qui automatizes la majeure partie du flux de travail pour l’échantillonnage aléatoire.
Enquêtes des caractéristiques ultrastructurales des neurones et leurs synapses ne sont possibles avec la microscopie électronique. Surtout pour des études comparatives des changements dans la densité et les distributions de ces caractéristiques, un protocole d’échantillonnage non biaisé est vital pour des résultats fiables. Nous présentons ici un “workflow” pour l’acquisition de l’image des échantillons de cerveau. Le workflow permet un échantillonnage aléatoire systématique uniform dans une région du cerveau définie, et les images peuvent être analysées à l’aide d’un disector. Cette technique est beaucoup plus rapide qu’un examen approfondi des coupes sériées, mais présente toujours une approche possible pour estimer les densités et les distributions des caractéristiques de l’ultrastructure. Avant l’intégration, tachée vibratome sections ont été utilisées comme référence pour identifier la zone du cerveau sous enquête, qui a contribué à accélérer la préparation de l’échantillon global du processus. Cette approche a été utilisée pour des études comparatives sur les effets d’un environnement enrichi-logement sur plusieurs paramètres ultrastructurales dans le cerveau de souris. Basé sur l’utilisation efficace du flux de travail, nous avons adapté aux fins de l’analyse élémentaire des échantillons de cerveau. Nous avons optimisé le protocole en fonction du temps d’interaction utilisateur. Automatisation de toutes les étapes fastidieuses à compiler un script pour le logiciel open source SerialEM permet à l’utilisateur de se concentrer sur l’essentiel du travail d’acquérir les cartes élémentaires. Comme dans le flux de travail original, nous avons prêté attention à l’approche d’échantillonnage non biaisé pour garantir des résultats fiables.
En microscopie électronique, il est souvent difficile de goûter des régions représentatives au sein des sections. Nous, en qualité d’observateur, sommes souvent biaisées pour ressembler à des régions spécifiques portées à notre attention par remarquables caractéristiques de l’échantillon, empêchant un échantillonnage non biaisé bien réparti. Échantillonnage de partialité ne peut être évité que si toutes les parties de la région d’intérêt obtient les mêmes chances de se retrouver dans une micrographie électronique1. Il est possible d’éviter les biais d’échantillonnage sans une solution de logiciel, par exemple, en appuyant sur la trackball du microscope manuellement sans regarder l’image, afin de sélectionner les régions d’échantillonnage où la scène s’arrête. Mais, à proprement parler, ce n’est pas une procédure aléatoire, parce que, consciemment ou inconsciemment, l’utilisateur peut avoir une influence sur le mouvement de la scène, et, en outre, ce n’est pas une manière sophistiquée de sélection des régions d’échantillonnage. Échantillonnage aléatoire devient particulièrement important si les paires des sections sont utilisés pour évaluer le nombre de structures dans un certain volume, par exemple, stéréologie1, qui nécessite des paires des sections, une distance connue apart. Il serait également possible de regarder seulement une seule section et estimer le nombre de structures spécifiques2, mais avec cette approche enquêteurs ont tendance à surestimer la densité numérique de structures plus grandes, à moins que les structures sont de très petites comparaison de l’épaisseur de coupe. Approches alternatives doivent reconstituer des volumes de tissus provenant de coupes sériées et ainsi obtenir les données souhaitées3. Mais c’est très longue et pas une approche possible pour les études comparatives (plus grands).
Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé un workflow qui permet au chercheur de sélectionner automatiquement des échantillons pour l’obtention de micrographies à espacement régulier au sein des sections ultra-minces. La position de la microscopie électronique est aléatoire, permettant d’échantillonnage non biaisé. L’approche est adaptée aussi bien pour la détermination de la densité numérique des structures (par exemple, les synapses dans un certain neuropile volume4,5) et les dimensions des caractéristiques structurelles (par exemple, la largeur de la fente synaptique, (ou le diamètre de la densité postsynaptique4,,5).
Le flux de travail utilise un point aléatoire sur mesure, d’échantillonnage (RPS) logiciel (écrit en Java script à l’aide de logiciel de script fourni avec notre microscope) qui calcule automatiquement les places sur la grille dans une région prédéfinie d’intérêt dans une section ultra-mince. Le logiciel RPS déplace la scène du microscope électronique à ces points prédéfinis, afin qu’un microscope électronique peut être effectué à chaque point. Tout d’abord, l’utilisateur définit une zone d’intérêt au sein de la section mince. Ensuite, le logiciel RPS calcule places sur la grille au sein de cette région. Le x / coordonnées de la première position sont créées aléatoirement, et les positions restantes sont placées à intervalles réguliers de grille en ce qui concerne la première position. Parce que toutes les parties de la région d’intérêt a les mêmes chances d’être examinés, cela permet la collecte de données minimale. Cette approche de l’échantillonnage est aussi appelée un échantillonnage aléatoire systématique uniform (voir référence6,,7 , pour plus de détails).
Pour déterminer la densité numérique des structures, nous travaillons avec paires de sections qui sont une distance connue apart. Après avoir obtenu une micrographie électronique de la première section dans une des positions prédéterminées, logiciel TEM Section série (partie du package logiciel fourni avec notre microscope électronique) se déplace vers le point correspondant dans la deuxième section, afin de obtenir un micrographe de l’emplacement correspondant. Cela est répété pour chaque emplacement dans la grille prédéterminée. Dans notre approche, un disector est utilisé pour compter le nombre de particules dans chaque paire de micrographies8,9. Un disector se compose d’une paire d’images de comptage, un pour chaque section8,9. La densité numérique des objets est déterminée en comptant seulement les objets visibles sur la première section (ou section de référence), mais pas à la deuxième section (section de recherche). Cela permet d’estimer la densité numérique des objets dans une manière rapide et efficace8,9. En outre sur des coupes simples, deux dimensions caractéristiques structurelles peuvent être mesurés.
Nous avons appliqué ce flux de travail avec succès afin d’évaluer les différences de nombre de synapse dans l’hippocampe de souris exposées à l’environnement enrichi (EE) par rapport à l’environnement standard (SE) logement conditions4,5, de conditions de logement et aussi pour évaluer les différences ultrastructurales entre les souris de type sauvage (WT) et le neuropeptide Y (NPY) KO souris maintenues sous soi et EE5. Notre objectif consistait à examiner plus précisément les caractéristiques structurales des neurones, comme la densité numérique synaptique, les longueurs de la zone active dans les coupes et de la densité postsynaptique, la largeur de la fente synaptique et le nombre de vésicules synaptiques, afin d’évaluer les changements de connectivité neuronale et l’activation entre les différentes conditions expérimentales. En outre, nous étions intéressés par la densité numérique des vésicules de noyau dense (DCV) dans les neurones pour déterminer le montant des neuropeptides stockée dans une certaine région du cerveau.
Basé sur le succès de notre approche pour les études décrites ci-dessus, dans notre prochaine étape, nous avons adapté notre workflow pour sélectionner les zones pour les analyses élémentaires non biaisées dans des échantillons de cerveau humain. Cela a été fait au fer d’image, qui est stocké dans les molécules de ferritine dans les neurones et les cellules gliales. Pour ce faire, nous avons compilé un script qui nous a permis d’automatiser la plupart des opérations pour un processus de sélection aléatoire des sections de cerveau dans une zone définie.
Le flux de travail présentée ici permet au chercheur d’obtenir des données sur les caractéristiques ultrastructurales de façon impartiale. C’est beaucoup moins de temps que les enquêtes de volume de coupes sériées. Plusieurs applications différentes sont utilisées pour atteindre cet objectif. Dans un premier temps, notre logiciel RPS sur mesure (pour plus de détails sur la disponibilité, veuillez contacter l’auteur-correspondant) est utilisé pour introduire un décalage aléatoire-étape pour sélectionner les coordonnées de zone d’échantillonnage. Cela permet un échantillonnage aléatoire systématique et uniform du ROI. Ensuite, pour le dépouillement de structures spécifiques, nous avons adapté la méthode de disector, où sont comparées les 2 sections consécutives avec distance connue, d’une manière nouvelle par rapport aux précédentes études13,14,15 , que nous avons utilisé notre logiciel RPS sur mesure pour un échantillonnage aléatoire systématique uniform. Cela fait gagner du temps par rapport à la 3D-reconstruction des volumes entiers de coupes sériées. Le logiciel RPS sur mesure est développé spécifiquement pour un type de microscope qui est un facteur limitant pour la reproduction du flux de travail. Une alternative de ce logiciel spécifique serait une application qui permet aux scripts et est compatible avec d’autres modèles de microscope.
Nous avons utilisé avec succès cette approche pour nos études comparatives4,5. Sur les sections ultra-minces de tissu neuronal, la zone d’intérêt a été exposée et images ont été prises par un échantillonnage aléatoire systématique et uniform dans ce domaine. Il est à noter que la zone d’intérêt, la couche polymorphe du gyrus denté, est une zone assez petite pour enquêter sur qui pourrait être bénéfique pour notre approche. Dans un disector placé au hasard, nous avons évalué le nombre de DCV et plusieurs caractéristiques ultrastructurales des synapses dans le guidage de souris adultes logés dans la SE et EE, en plus d’adulte WT souris par rapport à des souris knockout NPY adultes. Grâce à notre approche, les données recueillies ont montré des changements dans certains des paramètres étudiés. Ces résultats confirment ceux d’autres études similaires chez les jeunes animaux2.
L’inconvénient de l’utilisation expérimentale de ce flux de travail peut être que cette approche multi-demande n’est pas idéale en termes de facilité d’utilisation, comme les utilisateurs doivent se familiariser avec différentes interfaces utilisateur (dans notre cas, l’interface utilisateur, Section Serial TEM le logiciel RPS et le logiciel SerialEM). Apprendre à gérer toutes les demandes de façon efficace prend du temps et doit être pris en compte. Cependant, investir dans le temps à apprendre à utiliser ce flux de travail est toujours clairement favorable au fil du temps qui est nécessaire pour analyser des volumes entiers avec serial section TEM. La méthode d’utilisation d’un disector passée un échantillonnage aléatoire systématique et uniform dans la zone d’intérêt est suffisante pour présenter des données fiables1 sans la nécessité d’enquêter sur une grande quantité de sections/volume.
Afin de maximiser les résultats de nos études, il était vital de prendre bien soin durant la préparation de l’échantillon, comme la préservation des tissus et les structures n’est pas seulement indispensable pour l’évaluation des caractéristiques structurelles, mais aussi pour identifier le domaine d’intérêt sans ambiguïté. Un facteur crucial et peut-être un autre inconvénient de cette méthode, est qu’il faut une haute qualité des paires ultra minces : il ne doit y avoir aucune perforation ou les rides qui couvrent la zone incriminés dans une des sections, et l’épaisseur de coupe doit être maintenue homogène. Le chercheur doit être bien formé en ultramicrotomy. Soin doit être pris lors de l’imagerie, les sections dans le TEM, comme les sections sont sensibles aux dommages de faisceau d’électrons et peuvent facilement déchirer. En outre, il est important de choisir le bon nombre de zones d’échantillonnage dans le retour sur investissement. Selon le but expérimental, le grossissement de la microscopie électronique doit être définie avec précaution. Pour nos expériences spécifiquement, comptage des synapses dans le système nerveux central, 20 régions d’intérêt sur une partie avec la zone de 30,25 µm2 sont optimales. Il est conseillé de former le personnel bien en reconnaissant les caractéristiques en question (dans notre cas de synapses, fonctions synaptiques et DCV) pour obtenir des résultats fiables. Afin d’identifier les synapses, les vésicules synaptiques doivent être identifiables et cela nécessite une résolution d’au moins 10 nm. Pour ce faire, un grossissement de 5000 X était optimal, mais il est à noter que le grossissement dépend de paramètres matériels tels que le type et la position des caméras et devra être adapté pour d’autres types de microscope ou l’appareil photo. Il faut également noter que le protocole utilise des applications spécifiques à une TEM et que les utilisateurs avec d’autres modèles devront examiner les différences dans les paramètres.
Nous croyons que notre flux de travail peut être adapté pour de nombreuses autres applications non seulement en neurosciences, mais dans un large champ de sciences biologiques et sciences des matériaux (lorsque la haute résolution d’un TEM est nécessaire) chaque fois que la question de la recherche exige un uniforme systématique un échantillonnage aléatoire et la quantité d’échantillons à examiner demande un moyen efficace de temps d’analyse. Par exemple, nous nous intéressons actuellement dans la localisation des réserves de fer dans le cerveau humain. Pour ce faire, nous avons récemment adapté notre flux de travail, afin de permettre l’analyse élémentaire sur les sections ultra-minces dans des domaines choisis au hasard. Afin de minimiser le nombre de demandes qui sont nécessaires pour le flux de travail, nous avons cherché à appliquer en utilisant le logiciel de SerialEM seulement, car il peut être programmé pour passer à l’étape de pré-définir des points qui peuvent être sélectionnés de façon aléatoire. Nous avons créé des scripts personnalisés pour contrôler le TEM, dans le but d’automatiser le flux de travail entièrement. Cela s’avère possible, à l’exception de l’autofocus en mode imagerie filtré, qui n’ont pas donné de résultats satisfaisants. Ainsi, nous avons utilisé logiciel DM pour mise au point et pour obtenir les images filtrées énergie.
En résumé, nous présentons des solutions logicielles qui aident à obtenir les micrographies de manière impartiale.
The authors have nothing to disclose.
Financé par le numéro de projet Fonds autrichien des sciences, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |