We introduceren een nieuwe workflow voor elektronenmicroscopie onderzoek van hersenweefsel. De methode kan de gebruiker te onderzoeken van neuronale functies op onpartijdige wijze. Voor elementair-analyse presenteren wij ook een script dat de meeste van de workflow voor gerandomiseerde steekproeven automatizes.
Onderzoeken van de ultrastructurele kenmerken van neuronen en hun synapsen zijn alleen mogelijk met elektronenmicroscopie. Vooral voor vergelijkende studies van de veranderingen in dichtheid en distributies van dergelijke functies is een onbevooroordeelde bemonstering protocol essentieel voor betrouwbare resultaten. Hier presenteren we een workflow voor het image aquisition van monsters van de hersenen. De werkstroom kunt systematische uniforme steekproeven binnen een gedefinieerde hersenen-regio, en de beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van een disector. Deze techniek is veel sneller dan uitgebreid onderzoek van seriële secties, maar nog steeds presenteert een haalbare aanpak voor het inschatten van de dichtheden en distributies van ultrastructuur functies. Voor het insluiten, werden gekleurd vibratome secties gebruikt als een verwijzing te identificeren van de regio van de hersenen onderzocht, welke geholpen versnellen de algehele specimen voorbereiding verwerken. Deze aanpak werd gebruikt voor vergelijkende studies onderzoeken van het effect van een verrijkt-huisvesting-omgeving op verschillende ultrastructurele parameters in de hersenen van de muis. Op basis van het succesvolle gebruik van de werkstroom, wij het aangepast met het oog op elementaire analyse van monsters van de hersenen. We geoptimaliseerd het protocol in termen van de tijd van de interactie van de gebruiker. Alle tijdrovende stappen automatiseren door het opstellen van een script voor de open sourcesoftware SerialEM helpt de gebruiker om zich te concentreren op het hoofdwerk van het verwerven van de elemental kaarten. Net als in de oorspronkelijke workflow besteed we aandacht aan de onbevooroordeelde bemonstering aanpak garanderen van betrouwbare resultaten.
In elektronenmicroscopie is het vaak uitdagend om te proeven van de representatieve regio’s binnen de secties. Wij, zijn als waarnemer vaak bevooroordeeld om te kijken naar specifieke regio’s die onder onze aandacht gebracht door opvallende kenmerken van het monster, een goed gedistribueerd, onbevooroordeelde bemonstering voorkomen. Bemonstering van vooringenomenheid kan alleen voorkomen worden als elk deel van de regio van belang dezelfde kans krijgt terecht te komen in een elektron opname1. Het is mogelijk om te voorkomen dat bemonstering bias zonder een softwareoplossing, bijvoorbeeld door te drukken op de trackball van de Microscoop handmatig zonder te kijken naar de afbeelding, zodat het selecteren van bemonstering regio’s waar de fase stopt. Maar strikt genomen is dit niet een willekeurige procedure, omdat, bewust of onbewust, de gebruiker kan een invloed hebben op het verkeer van het podium, en, bovendien, dit is niet een verfijnde manier van de selectie van de bemonstering regio’s. Aselecte steekproef wordt met name belangrijk als paren van secties worden gebruikt voor het beoordelen van het aantal structuren in een bepaald volume, bijvoorbeeld voor stereology1, waarvoor paren van secties, een bekende afstand van elkaar. Het zou ook mogelijk alleen kijken met een enkele sectie en het aantal specifieke structuren2schatten, maar met deze aanpak onderzoekers hebben de neiging te overschatten van de numerieke dichtheid van grotere structuren, tenzij de structuren zeer klein zijn vergelijking met de dikte van de sectie. Alternatieve benaderingen zijn het reconstrueren van de volumes van weefsel van seriële secties en dus krijgt de gewenste gegevens3. Maar dit is zeer tijdrovend en niet een haalbare aanpak voor (grotere) vergelijkende studies.
Om deze problemen te overwinnen, hebben wij een workflow waarmee de onderzoeker om automatisch te selecteren monsters voor het verkrijgen van electron microfoto op regelmatige afstand binnen uiterst dunne secties ontwikkeld. De positie van de electron microfoto is willekeurig, waardoor onbevooroordeelde bemonstering. De aanpak is geschikt zowel voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren (bijvoorbeeld synapsen binnen een bepaalde neuropil volume4,5), en de afmetingen van structurele kenmerken (bijvoorbeeld de breedte van de synaptische gespleten, of de diameter van het postsynaptisch dichtheid4,–5).
De werkstroom gebruikt een op maat gemaakte willekeurig punt bemonstering (RPS) software (geschreven in de Java-script met behulp van Scripting software geleverd met onze Microscoop) die automatisch grid posities binnen een vooraf gedefinieerde regio van belang in een ultra-dunne sectie berekent. De RPS-software wordt het stadium van de elektronenmicroscoop verplaatst naar deze vooraf gedefinieerde punten, zodat een elektron opname kan worden gemaakt op elk punt. De gebruiker definieert eerst, een regio van belang binnen de dunne sectie. Vervolgens berekent de RPS software grid posities binnen deze regio. De x / y-coördinaten van het eerste standpunt willekeurig worden gemaakt, en de resterende posities worden aan regelmatige raster intervallen met betrekking tot de eerste positie geplaatst. Omdat elk deel van de regio van belang dezelfde kans heeft van onderzocht, hierdoor minimale gegevensverzameling. Deze aanpak van de bemonstering heet ook systematische uniforme aselecte steekproef (zie referenties6,,7 voor meer details).
Voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren, werken wij met paren van secties die een bekende afstand van elkaar. Na het verkrijgen van de opname van een elektron uit het eerste gedeelte in een van de vooraf bepaalde posities, verhuist TEM seriële sectie software (onderdeel van het softwarepakket geleverd met onze elektronenmicroscoop) naar de overeenkomstige punt in de tweede sectie, ter de opname van een elektron van de bijbehorende locatie te verkrijgen. Dit wordt herhaald voor elke locatie in het vooraf vastgestelde rooster. In onze aanpak, wordt een disector gebruikt om het aantal deeltjes in elk paar van electron microfoto8,9te tellen. Een disector bestaat uit een paar counting frames, één voor elke sectie8,9. De numerieke dichtheid van objecten wordt bepaald door alleen tellen objecten zichtbaar op de eerste sectie (of naslaggedeelte) maar niet op de tweede sectie (of opzoeken sectie). Hierdoor te schatten van de numerieke dichtheden van objecten in een snelle en efficiënte manier8,9. Bovendien op enkele secties, kunnen twee-dimensionale structurele kenmerken worden gemeten.
Wij hebben deze werkstroom met succes om te beoordelen van de verschillen in aantallen van de synaps in de hippocampus van muizen blootgesteld aan verrijkte omgeving (EE) woonomstandigheden in vergelijking met standaard omgeving (SE) huisvesting voorwaarden4,5, toegepast en ook om te evalueren van de ultrastructurele verschillen tussen wild type (WT) muizen en neuropeptide Y (NPY) KO muizen onder SE en EE5gehouden. Ons doel was om te kijken specifiek structurele kenmerken van neuronen, zoals de numerieke synaptic dichtheid, de lengtes van de actieve zone in dwarsdoorsneden en het postsynaptisch dichtheid, de breedte van de synaptische gespleten, en het aantal synaptische vesikels, teneinde veranderingen in neuronal connectiviteit en activering tussen de verschillende experimentele omstandigheden. Bovendien, waren we geïnteresseerd in de numerieke dichtheid van dichte-core blaasjes (DCV) in neuronen te bepalen van de hoeveelheid opgeslagen neuropeptides in een bepaald gebied van de hersenen.
Op basis van het succes van onze aanpak voor de studies die hierboven beschreven, in onze volgende stap, we hebben het aangepast van onze workflow Schakel gebieden voor onbevooroordeelde elemental analyses binnen de menselijke hersenen monsters. Dit werd gedaan om de afbeelding ijzer, dat is opgeslagen in de Ferritine moleculen in zowel zenuwcellen en gliacellen. Hiervoor samengesteld we een script dat ons voor het automatiseren van de meeste bewerkingen voor een willekeurige screening van hersenen secties in een bepaald gebied toegestaan.
De hier gepresenteerde werkstroom kan de onderzoeker om gegevens over ultrastructurele kenmerken op onpartijdige wijze. Dit is veel minder tijdrovend dan volume onderzoeken van seriële secties. Verschillende toepassingen worden gebruikt om dit doel te bereiken. In eerste instantie onze op maat gemaakte RPS -software (voor gegevens over de beschikbaarheid, neem contact op met de overeenkomstige auteur), wordt gebruikt om een willekeurige fase-verschuiving Schakel de bemonstering gebied coördinaten. Hierdoor is een systematische uniforme aselecte steekproef van de ROI. Vervolgens voor het tellen van specifieke structuren, aangepast we de disector methode, waar 2 opeenvolgende secties met bekende afstand worden vergeleken, in een nieuwe manier in vergelijking met eerdere studies13,14,15 , zoals we plachten onze op maat gemaakte RPS software voor systematische uniforme steekproeven. Dit bespaart tijd in vergelijking met 3D-reconstructie van gehele volumes van seriële secties. De op maat gemaakte RPS-software is speciaal ontwikkeld voor een bepaald type van Microscoop die een beperkende factor is voor het reproduceren van de werkstroom. Een alternatief van deze specifieke software zou een toepassing waarmee scripts en is compatibel met andere Microscoop modellen.
Wij met succes gebruikt deze aanpak voor onze vergelijkende studies4,5. Op uiterst dunne secties van neuronale weefsel, de interessegebied werd geschetst en beelden werden genomen door systematische uniforme steekproeven binnen dit gebied. Het dient te worden opgemerkt dat het gebied van belang, de polymorf laag van het getand gyrus, een vrij klein gebied is te onderzoeken die wellicht nuttig zijn voor onze aanpak. Binnen een willekeurig geplaatste disector, we het aantal DCV geëvalueerd en diverse ultrastructurele kenmerken van synapsen in de DGpl van volwassen muizen gehuisvest in SE en EE evenals volwassen WT muizen versus volwassen NPY knock-out muizen. Met behulp van onze aanpak, de verzamelde data toonde veranderingen in een aantal van de onderzochte parameters. Deze bevindingen bevestigd die van andere soortgelijke studies in jonge dieren2.
Een nadeel van het experimentele gebruik van deze werkstroom kan worden dat deze multi-application-aanpak niet ideaal in termen van gebruiksgemak, is als de gebruikers nodig hebt om comfortabel met verschillende user-interfaces (in ons geval, de gebruikersinterface, TEM seriële sectie de RPS software en SerialEM software). Leren omgaan met alle toepassingen op een efficiënte manier is tijdrovend en rekening moet worden gehouden. Investeren de tijd in het leren gebruiken van deze workflow is echter nog steeds duidelijk gunstige na verloop van de tijd die nodig is voor het analyseren van gehele volumes met seriële sectie TEM. De methode van het gebruik van een disector geplaatst door systematische uniforme aselecte steekproef op het gebied van belang is voldoende om te presenteren betrouwbare gegevens1 zonder de noodzaak te onderzoeken van een hoog bedrag van secties/volume.
Maximaliseren van de uitkomst in onze studies, was het essentieel voor de goede zorgen tijdens de bereiding van de monsters, zoals het behoud van het weefsel en de structuren niet alleen cruciaal is voor de evaluatie van de structurele kenmerken, maar ook voor het terrein van belang ondubbelzinnig te identificeren. Een cruciale factor, en misschien een ander nadeel van deze methode is dat een hoge kwaliteit van de ultra-dunne secties paren vereist: moeten er geen gaten of rimpels die betrekking hebben op het gebied onder onderzoek in een van de secties en de dikte van de sectie moet worden homogene gehandhaafd. De onderzoeker moet goed opgeleide in ultramicrotomie. Zorg moet ook worden genomen bij de beeldvorming van de secties in de TEM, zoals de secties gevoelig voor electron beam schade zijn en kunnen gemakkelijk uit elkaar scheuren. Bovendien is het belangrijk om te kiezen van het juiste aantal bemonstering gebieden in de ROI. Afhankelijk van de experimentele doel moet de vergroting van de electron microfoto zorgvuldig worden ingesteld. Voor onze experimenten specifiek, zijn tellen synapsen in het centrale zenuwstelsel, 20 regio’s van de rente over een sectie met de oppervlakte van 30.25 µm2 optimaal. Het is aangeraden om het personeel goed in het herkennen van de functies in kwestie (in ons geval synapsen, synaptic functies en DCV) om betrouwbare resultaten te trainen. Teneinde de synapsen, de synaptische vesikels herkenbaar moeten zijn en dit vereist een resolutie van minstens 10 nm. Hiervoor een vergroting van 5000 X was optimaal, maar er moet worden opgemerkt dat de vergroting hangt af van hardware parameters zoals het type en de positie van de camera’s en moeten zou worden aangepast voor andersoortige Microscoop en/of camera. Het heeft ook te worden opgemerkt dat het protocol toepassingen specifiek voor één TEM gebruikt en dat gebruikers met andere modellen moeten overwegen de verschillen in de instellingen.
Wij geloven dat onze workflow kan aangepast worden voor vele andere toepassingen niet alleen in de neurowetenschappen, maar op een breed gebied van biologische wetenschappen en ook Materiaalkunde (wanneer de hoge resolutie van een TEM nodig is) wanneer de onderzoeksvraag vraagt om een systematische uniform steekproeven en de hoeveelheid monsters worden onderzocht vraagt om een tijd-efficiënte manier van analyse. Bijvoorbeeld, zijn wij momenteel ook geïnteresseerd bij het lokaliseren van ijzer winkels in de menselijke hersenen. Hiervoor hebben wij onlangs onze workflow, zodat de elementaire analyse op uiterst dunne secties op willekeurig gekozen gebieden aangepast. Oog op het minimaliseren van het aantal toepassingen die nodig zijn voor de workflow, we gericht toe te passen met behulp van de SerialEM software alleen, omdat het kan worden geprogrammeerd voor het verplaatsen van het werkgebied om vooraf punten die kunnen worden geselecteerd in een willekeurige mode. We aangepaste scripts om te controleren de TEM, met als doel de workflow volledig automatizing gemaakt. Dit bleek mogelijk met uitzondering van de autofocus in gefilterde imaging modus, die deed geen bevredigende resultaten opleveren. We gebruikten dus DM software voor scherpstellen en voor het verkrijgen van de energie-gefilterd beelden.
Kortom presenteren we software-oplossingen die helpen bij het verkrijgen van electron microfoto op een onpartijdige manier.
The authors have nothing to disclose.
Gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds, FWF, projectnummer P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |