수용 체 Ligand 상호 작용을 공부 하기 위한 BW 기자 시스템

1. 공상 건설을 표현 하는 플라스 미드의 생성 참고: 목표 마우스 CD3ζ 체인 (그림 2A)의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합의 수용 체의 세포 외 도메인을 표현 하는 플라스 미드를 생성 하는. 신호 펩 티 드를 포함 하 여 관심의 수용 체의 세포 외 도메인의 시퀀스를 검색 합니다. (예를 들어, cDNA 또는 한 플라스 미드)이 수용이 체를 표현 하기 위해 예상 되는 DNA 자료를 얻을. DNA 자료를 표현 하는 막 횡단 및 마우스 CD3ζ 체인의 세포내 도메인 (예., cDNA 또는 한 플라스 미드). 그림 2A에 표시 된 일반적인 구조에 따라 융해 단백질의 시퀀스를 디자인 합니다. 전체 시퀀스 프레임 내에 동일한 codon 읽는 다는 것을 확인 하십시오. 이 순서는 적절 한 뇌관을 디자인 하 고 최종 제품을 확인 하는 데 사용 됩니다. 융해 단백질의 파편의 각각을 별도로 증폭 하는 두 개의 PCR 반응 디자인 (그림 2B, 2c)10.참고: PCR 반응에 대 한 특정 조건 (예., 신장 시간 및 어 닐 링 온도)는 특정 수용 체를 위한 뇌관의 성격에 따라 달라 집니다. 수용 체의 extracellular 세그먼트를 증폭. 수용 체, Kozak 합의 시퀀스, 그리고 적절 한 제한 사이트 (그림 2B)의 신호 펩 티 드의 부분을 포함 5 개의 ‘ 뇌관 디자인. Flanks 융합 단백질 (그림 2B)의 두 부분 3′ 뇌관 디자인. 예를 들어 초기 디자인에 대 한이 3′ 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 9 기본적인 쌍의 마지막 20의 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다.참고: 거기 아무 필요도 금지 사이트를 추가 3′ 뇌관이이 뇌관 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 및 결 찰에 대 한 사용 되지 않습니다. CD3ζ 세그먼트를 증폭. 5’ 뇌관 flanks 융합 단백질 (그림 2C)의 두 부분을 디자인 합니다. 예를 들어 초기 디자인에 대 한 5 개의 ‘ 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 20 기본적인 쌍의 마지막 9 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다.참고:이 입문서 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 고 결 찰을 사용 하지 않는 5 개의 ‘ 뇌관 제한 사이트를 추가할 필요가 없습니다 있다. CD3ζ 시퀀스를 적절 한 제한 사이트 (그림 2C)의 끝을 포함 하는 3’ 뇌관 디자인. 어 닐 링 온도 각 쌍 (두 부분 융해 단백질의 시퀀스를 포함, 뇌관만 각 반응에서 시퀀스의 부분 anneals 참고)에 비슷한이 두 반응의 각 뇌관 시퀀스를 수정 합니다. 처음 두 반응의 PCR 제품의 혼합물과 세포 외 수용 체 세그먼트 (단계 1.4.1.1)의 5 개의 ‘ 뇌관은 3’ CD3ζ 세그먼트 (단계 1.4.2.2)의 (그림 2D)10 DNA 템플렛으로 사용 되는 추가 PCR을 수행 . 이 반응 최종 융합된 시퀀스를 생성 해야 합니다. 복제에 대 한 평소와 같이 진행 합니다. 벡터 (대상 벡터는 일반적으로 G418 및 암 피 실린 저항을 표현 하는 pcDNA3)을 삭감 대상에 최종 PCR 제품 선 유능한 박테리아11에 합자 벡터 변환. 얼음에 유능한 박테리아의 50 µ L 해빙 박테리아에 합자 벡터를 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어. 42 ° C 45에서 품 어 s. 항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다. 연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 적절 한 항생제 (예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션)와 파운드 플레이트에 씨. 수집 하 고 (15 mL 튜브)에 파운드의 5 mL에 여러 가지 세균성 식민지 성장. 다음 날, 미니 준비 키트와 플라스 미드 추출 합니다. 제한 효소와 유전자 삽입을 분석 합니다. 시퀀싱 관련 식민지 하 고 시퀀스와 독서 프레임 올바른지 확인 (같이 1.3 단계에서에서). 유능한 박테리아11로 확인 된 플라스 미드를 변환. 20 µ L 얼음에 유능한 박테리아의 해빙 박테리아에 플라스 미드의 1 µ L을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어. 42 ° C 45에서 품 어 s. 항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다. 연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어. (예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션) 적절 한 항생제로 세균성 성장 플레이트에 씨. 다음 날, 0.1 mg/mL 암 피 실린 (~ 250 mL)와 큰 파운드 컨테이너에 세균성 식민지 성장. 다음 날, 맥시 준비 키트에서 제공 하는 특정 지침에 따라 수행 합니다.참고: electroporation 절차에 대 한 대량 플라스 미드가 아래로 필요 합니다. 2. transfection BW 셀에 공상 단백질을 표현 하는 플라스 미드의 참고: 다른 방법 transfection를 위해 채택 될 수 있다 또한 (예를들면., lentiviral 감염). Electroporation, 전에 아래와 같이 DNA의 에탄올 강수량을 수행 합니다. 다음 단계는 무 균 조건 필요합니다. 하루 전에, electroporation는 BW5147 셀 (“BW”) 준비. 접시 10 접시 (10 cm) 100000 BW5147 셀/mL의 (즉, 10 x 106 세포의 총) 10 mL와 RPMI 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 1 %L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1%와 보충 페니실린-스 (“완전 한 매체”). 1.5-2 mL 튜브에 융해 단백질을 표현 하는 pcDNA3 플라스 미드의 100 µ g 놓고 그것에 pH 5.3-5.5에서 3m 나트륨 아세테이트를 추가 합니다. 나트륨 아세테이트의 볼륨 100 µ g 플라스 미드의 볼륨의 0.1 (10%)에 해당 한다; NaOH 또는 HCl를 추가 하 여 pH 미터를 가진 나트륨 아세테이트의 pH를 적정 하십시오. 2.2 단계 (2.5 엑스 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 총 거래량)에 설명 된 대로 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 혼합물에 100% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. 70 ° c.에서 2 h 또는-20 ° C에서 밤새 품 어 2.4. 24 h 후 BW 셀 도금 되었습니다, 모든 BW 셀 (~ 100 mL) 2 50 mL 튜브에 수집 합니다. 515 x g 에 5 분에 대 한 셀을 원심 및 삭제는 상쾌한. 다시 25 mL RPMI-단일 50 mL 튜브에서에 두 튜브에서 펠 릿을 일시 중단 합니다. 예를 들어 다시 25 mL RPMI-와 1 개의 관의 펠 릿을 일시 중지 하 고이 액체를 사용 하 여 다시 뷔 셀에서 총 펠 릿 다시 단일 튜브에 매체의 25 mL에 일시 중지 되도록 다른 50 mL 튜브에 액체를 일시 중단.참고: 매체 이어야 한다 추가 없이 혈 청 electroporation 방해할 수도 있기 때문. 515 x g에 5 분 동안 다시 셀 원심 다시 RPMI의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 얼음에 0.4 cm 베트 내용을 전송. 16000 x g 와 4 ° C에서 30 분 동안 에탄올 강수량 (2.3 단계)를 받았다 플라스 미드를 원심 70% 에탄올과 다른 20 분 16000 x g 와 (를 소금) 4 ° C에서 원심 분리기의 1 mL로 한 번 씻어. 모든 에탄올을 제거 하 고 약간 건조 한 펠 릿 (즉, 조직 문화 후드에서 오픈 관에서). 다시 100 µ L의 RPMI-이전 60 ° c가 열 된 펠 릿을 일시 중단 다시 일시 중단 된 플라스 미드 (단계 2.8)는 베트에 셀을 추가 하 고 얼음에 5 분 동안 품 어. Electroporate 0.23에서 셀 kV, 250 capacitation. 이 ~ 4 ms를 취해야 한다. 50 mL 튜브에 electroporated 세포를 전송, 515 x g. 에서 완전 한 매체 및 5 분 동안 원심 분리기의 50 mL를 추가 상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 매체의 50 mL와 함께 셀을 일시 중단. 24 잘 문화 요리 (1 mL 당 50 ~ 웰 스의 총 잘) electroporated 셀 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2 48 h에 품 어. 항생제로 transfected 셀을 선택 합니다. 48 h 추가 10 mg/mL G418 각 잘 보완 하는 완전 한 매체의 1 mL (이 단계에서 각 마지막 볼륨 잘 2 mL 이며 각 G418의 최종 농도 잘 5 mg/mL).참고: 다른 항생제 내성 플라스 미드 있으면이 단계 전에 untransfected BW 세포를 죽 일 하는 데 필요한 항생제 농도 결정 합니다. 모든 48 h 신중 하 게 우물에서 매체를 교 반 하지 않고 각의 위쪽 볼륨의 1 mL를 삭제 (BW 세포는 우물의 바닥에 있을 하는 경향이 있다). 각 잘에서 최종 볼륨은 다시 2 mL 5 mg/mL G418 각 음을 보충 하는 완전 한 매체를 추가 합니다. 모든 우물에서 세포 성장 위한 문화 접시를 정기적으로 검사 합니다.참고: 노란색 매체의 색상에서 변경 수 있습니다 식별할 성장 세포; 그러나, 처음에 매체 됩니다 노란색에 G418 때문에 자체. 양수 우물 (웰 스 성장 하는 세포)를 식별 합니다. 이 우물 G418 방지 되며 따라서 융해 단백질을 표현할 것으로 예상 된다. 이 프로세스는 일반적으로 3 주 걸립니다. 3. 긍정적인 우물에서 셀에 Transfected 수용 체의 식의 확인. 하 페는 수용 체에 대 한 특정 항 체로 transfected BW 셀 얼룩. Cytometry는 제어 셀 (untransfected BW)의 표현에 의해 수용 체의 식 수준 비교. 확인 후 하나 이상의 우물의, 실험적인 목적을 위한 세포를 즉시 사용 하는 방법, 문화, 성장 또는 미래의 응용 프로그램에 대 한 동결. 새로운 실험을 수행 하기 전에 transfected 수용 체의 식을 확인 합니다. 성장, 안정 되어 있는 수용 체 식 G418 셀의 몇 주 후 G418 문화 매체에서 생략할 수 있습니다. 4. 보육 대상 Transfected BW 셀의 참고: transfected BW 셀을 사용 하 여 처음으로, 그것은 관심의 수용 체의 알려진된 리간드를 표현 하는 대상 또는 플레이트-바인딩 항 체 특히 관심 (cross-linking의 수용 체에 대 한 감독 들을 테스트 하는 것이 좋습니다. 실험; 아래 참조, 4.2.1.3 섹션). 가급적 이면, (예를 들어 새로운 10 cm 배양 접시에 문화에 있는 세포의 2 개 mL를 완전 한 매체의 10 mL을 추가) 하 여 BW 세포 실험 하기 전에 24 시간을 분할. 그들의 목표를 가진 transfected BW 세포를 품 어. 빈 벡터 (또는 부모의 BW 셀) 표현 하는 제어 BW 셀에 실험을 동시에 수행 합니다. 96F 격판덮개는 바람직 (하지만 96U 접시를 사용할 수 있습니다). 3 중에서 실험을 수행 합니다. 완전 한 매체에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다. 목표를 준비 합니다. 대상의 유형, 목표의 기능으로 변화 한다 그리고 사전에 항 체 또는 항 체 혼자 incubated 셀 수 있습니다. 이 시스템은 또한 대상5박테리아와 함께 사용 되었습니다. 목표 셀 (즉, 셀 라인) 분할 된다, 경우 6000 rad 분석 결과 이전에 그들을 비추는. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 대상 셀의 장소 50000. 항 체 및 인간 FcγRs을 표현 하는 BW 셀 실험 품 어 96 잘 접시에 얼음에 항 체와 대상 셀에 대 한 (예를 들어, 대상 셀의 50 µ L와 항 체;의 50 µ L에 대 한 서로 다른 항 체 투여 시험 될 수 있다). 혼자 항 체를 사용 하 여 (실험 cross-linking) 대상으로, 그들은 플레이트-바인딩을 해야한다. 이 위해 먼저 96F 접시 1-2 h 37 ° C, 5% CO2 (전형적인 시작 복용량은 50 μ에 특정 항 체의 0.5 μ g)에 대 한 완전 한 매체에 있는 항 체에 품 어. 언바운드 항 체를 제거 하는 접시를 씻는 다.참고:이 경우에, 96F 접시 하면 transfected 수용 체의 활성화로 이어질 것입니다 격판덮개 transfected BW 셀의 추가 후에 항 체의 바인딩이 있습니다. BW 세포 (effector 세포)를 추가 합니다. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 50000 BW 셀을 배치 합니다. 볼륨에 필요한 경우 200 µ L 각 잘 완료. 37 ° C, 5% CO2 48 h (이 기간 측정 될 수 있다)에 번호판을 품 어. 48 h 후-20 ° C와 ELISA, 전에 해 동 플레이트 고정 또는 ELISA 즉시 사용 (다음 단계 참조). 5입니다. 엘리 사 반대로 마우스 일리노이-2 항 체 (항 mIL-2)와 ELISA 격판덮개 코트. 잘 당 1 x PBS의 50 µ L의 볼륨에 반대로 mIL-2의 0.05 µ g를 배치 합니다. 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 반대로 mIL-2 항 체로 코팅된 ELISA 격판덮개를 품 어.참고: ELISA 인큐베이션 단계 후 직접 수행, ELISA 격판덮개 한다 코팅 24 h BW 셀의 잠복기의 끝 전에. ELISA 격판덮개에 액체를 폐기 하 고 1 x PBS와 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 구성 되는 차단 솔루션 (잘 당 200 µ L)를 추가 합니다. 실 온에서 2 h의 ELISA 격판덮개를 품 어. 세 번 0.05 %PBS 트윈 솔루션 (즉, 1 x PBS의 1 리터에서 트윈-20의 0.5 mL)와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오. 그들의 목표 (4.3)와 인 큐베이 팅 된 BW 셀 96 접시를 가져가 라. 접시, 냉동 하는 경우 완전히 녹여 (예., 여 37 ° C에 외피를 짧은). 원심 96 접시 (5 분, 515 x g) 고 신중 하 게 미리 코팅 및 차단 ELISA 격판덮개에 각 잘 상쾌한의 100 µ L를 전송.참고:는 상쾌한 셀을 복용 하지 않도록 각의 측면에서 수집 한다. 원하는 경우, 밀-2의 표준 곡선을 생성 하기 위해 코팅된 ELISA 격판덮개의 빈 행 중 하나에 정의 된 농도와 재조합 밀-2를 추가 합니다. 예를 들어 밀-2 2500 pg/mL의 농도에서 시작 하 고에 각 후속 잘; 50% 감소 추가 하지 마십시오 밀 2 마지막 잘. ELISA 격판덮개 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 품 어. 4 시간 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오. ELISA 격판덮개에 biotin 반대로 마우스 일리노이-2를 추가 합니다. 1 x 1 %BSA PBS의 1 mL에 1 µ g 항 체의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L를 나눕니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오. 활용 하는 HRP streptavidin을 추가 합니다. 1 %BSA PBSX1의 1 mL에 1 µ L streptavidin의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L로 나눕니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어. 6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오. TMB 기판 솔루션의 당 100 µ L를 추가 합니다. 때문에 시간을 뒤져는 TMB 추가할 때 우물 사이의 차이 최소화 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료 합니다. 650에서 ELISA 플레이트 리더 ELISA 격판덮개를 읽고 nm (읽기 수 신호가 약한 경우 반복).