Bereichern Sie und erweitern Sie seltene antigenspezifischen T-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln
Summary
Antigen-spezifische T-Zellen sind schwer zu charakterisieren oder Therapien aufgrund ihrer extrem niedrigen Frequenzen zu nutzen. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine magnetische Partikel zu entwickeln, die zur antigenspezifischen T-Zellen binden können, um diese Zellen zu bereichern und dann erweitern sie mehrere hundertfachen zur Charakterisierung und Therapie.
Abstract
Wir haben ein Werkzeug, um sowohl bereichern und erweitern antigenspezifischen T-Zellen entwickelt. Dies ist hilfreich in Fällen wie z. B. A) erkennen die Existenz von antigenspezifischen T-Zellen, B) Fühler die Dynamik der Antigen-spezifische Antworten, (C) verstehen wie Antigen-spezifische Reaktionen Krankheitszustand z. B. Autoimmunität beeinflussen, (D) entmystifizieren heterogenen Antworten für Antigen-spezifische T-Zellen, oder E) nutzen Antigen-spezifische Zellen für die Therapie. Das Tool basiert auf einem magnetischen Teilchen, dass wir konjugieren Antigen-spezifische und T-Zell co-stimulatory Signale und wir als künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) bezeichnen. Folglich, da die Technologie einfach herzustellen ist, kann es leicht von anderen Labors angenommen werden; Somit ist unser Ziel hier detailliert zu beschreiben, die Fertigung und die anschließende Nutzung der aAPCs. Wir erklären wie man Antigen-spezifische und co-stimulatory Signale an den aAPCs befestigen, wie man sie zu bereichern für Antigen-spezifische T-Zellen nutzen und wie Sie Antigen-spezifische T-Zellen zu erweitern. Darüber hinaus beleuchten wir Konstruktion Überlegungen anhand von experimentellen und biologische Informationen unserer Erfahrung mit Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen.
Introduction
Mit dem Aufstieg von vielen Immuntherapien muss man zu charakterisieren und Immunreaktionen Steuern zu können. Insbesondere ist die adaptive Immunantwort von Interesse wegen der Besonderheit und der Lebensdauer der Zellen. Vor kurzem, haben Chimären-Antigen-Rezeptor-T-Zell-Therapien für die Krebstherapie zugelassen sind; Allerdings basieren die Antigen-Rezeptoren aus gemeinsamen Zelle Oberflächenantigen CD19, anstatt die Antigene spezifisch für die Krebs-1. Darüber hinaus die Besonderheit können Immuntherapien auch der Mangel an Kontrolle und begrenzten Verständnis der dynamischen Immunantwort in Krebs oder Autoimmunität leiden.
Eine der Herausforderungen des Studiums Antigen-spezifische Reaktionen ist ihre extrem niedrigen Frequenzen, z. B.., Antigen-spezifische T-Zellen sind 1 von jeden 104 106 T Zellen2,3. So untersuchen die T-Zellen vorhanden sind oder als Reaktion, die Zellen bereichert und erweitert werden, oder ihr Signal müssen verstärkt werden. Es ist teuer und schwer zu pflegen die Feeder-Zellen mit aktuellen Techniken, die sich auf den Ausbau der Antigen-spezifische Zellen. Aktuelle Techniken, die im Fokus verstärkt das Signal des Antigen-spezifische T-Zellen, wie die Enzym-linked Immunospot (ELISPOT) assay, der Wiederverwendung von den T Zellen4zu begrenzen. Zu guter Letzt wegen geringer Sensitivität oft diese beiden Techniken für die Antigen-spezifische Aufzählung kombiniert werden müssen.
Um diese Probleme anzugehen, haben wir die magnetische Nanopartikel basierende künstliche Antigen präsentierenden Zelle (aAPC)5,6,7,8entwickelt. Die aAPC kann mit einem Antigen-spezifische Signalpeptid geladenen großen Histocompatibility Komplex (pMHC)- und co-stimulatory Molekülen – funktionalisiert werdenzB., Antikörpers Anti-CD28-beide bereichern antigenspezifischen T-Zellen und dann anschließend stimulieren Sie ihre Expansion (Abbildung 1). Die Partikel können somit eine kostengünstige handelsübliche Produkt sein, das können sowohl Antigen-spezifische Stimulationen angepasst noch standardisiert über Experimente und Patienten. Durchführung der Bereicherung und Erweiterung Ergebnisse in Hunderte bis Tausende-Fach Ausbau der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu verarbeiten und kann dazu führen, dass die Frequenzen bis zu 60 Prozent nach nur einer Woche, damit die Charakterisierung oder therapeutischen Einsatz der großen Anzahl der Zellen. Hierin, wir beschreiben, wie Nanopartikel aAPCs, einige kritische Überlegungen bei der Auswahl der Eigenschaften der Nanopartikel, machen und zeigen einige typische Ergebnisse von der Verwendung dieser Partikel zu isolieren und Ausbau seltene Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine neuartige antigenspezifischen T-Zellen Isolationstechnologie basierend auf Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) erstellt. Nanopartikel aAPCs haben Peptid-MHC auf der Oberfläche geladen, die Antigen-spezifische T-Zell-Bindung und Aktivierung neben co-stimulatory Aktivierung ermöglicht. aAPCs sind ebenfalls paramagnetisch und kann somit verwendet werden, um seltene antigenspezifischen T-Zellen mit einem magnetischen Feld bereichern. Wir haben optimiert und studierte wichtige Nanop…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. danke das NIH Krebs Nanotechnologie Training Center am Johns Hopkins Institut für Nanobiotechnologie, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) und die Bögen Foundation Fellowship Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung durch die National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835 R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovationsinitiative und Coulter Foundation (JPS) finanziert.
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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