Aquí describimos un ensayo basado en células para evaluar cuantitativamente la absorción tau por microglia con el objetivo de crear una herramienta de investigación para caracterizar mejor los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-tau.
Enfermedad de Alzheimer (EA) es una condición neurodegenerativa progresiva en la cual agrega los tau y las proteínas amiloides se acumulan en el cerebro causando una disfunción neuronal que eventualmente conduce a deterioro cognitivo. Agregados de tau hiperfosforilada en las neuronas se creen que causan la mayoría de la patología asociada con enfermedad de Alzheimer. Estos agregados son asumidos para ser lanzado en el compartimiento extracelular y tomados por las neuronas sanas adyacentes donde además inducen la agregación de tau. Este “prion-como” separarse puede ser interrumpido por los anticuerpos capaces de atar y “neutralizar” agregados de tau extracelular como se muestra en modelos de ratón preclínico de la EA. Uno de los mecanismos propuestos por el cual los anticuerpos terapéuticos reducen patología es anticuerpo-mediada de la absorción y limpieza de formas patológicas agregadas de tau por la microglia. Aquí, describimos un ensayo basado en células para evaluar la absorción de tau por la microglia. Este ensayo utiliza la línea de ratón microglia células BV-2, permite la alta especificidad y baja variabilidad de rendimiento medio. Datos generados con este análisis pueden contribuir a una mejor caracterización de funciones efectoras de los anticuerpos anti-tau.
Enfermedad de Alzheimer (EA) es una condición neurodegenerativa progresiva caracterizada por el cambio conformacional y autoensamblaje de la proteína de amiloide β péptido y tau en agregados patológicos. El péptido β amiloide soluble normal se convierte en oligomérica y fibrilar amiloide β, mientras que el tau anormalmente fosforilada se acumula como oligómeros y los enredos de neurofibrillary1,2. Estos agregados de proteína causan muerte neuronal que conduce a la pérdida de memoria y deterioro cognitivo progresivo posterior. Otros factores, incluyendo la neuroinflamación no productivos y una capacidad reducida para eliminar proteínas mal plegadas, pueden agravar y acelerar la enfermedad. En la actualidad, estrategias de intervención contra AD proporcionan alivio sintomático en gran parte, pero no hay modificadores de la enfermedad curación o prevención.
Creciente evidencia sugiere un papel clave de los agregados de tau hiperfosforilada en la patología de la EA. En su estado no patológico, tau es una proteína nativa desplegada que se une a los microtúbulos y promueve a su montaje en el citoesqueleto neuronal. Cuando tau hiperfosforilada, se separa del citoesqueleto y clusters en agregados de tau en las neuronas, que se creen que causan la mayoría de la patología asociada AD3. Agregados de tau empieza primero acumular intracelularmente, pero conforme avanza la enfermedad, se supone para ser lanzado de las neuronas afectadas en el espacio extracelular, desde donde se puede tomar por neuronas sanas adyacentes o synaptically conectadas en un ” PRION-como manera”. Una vez internalizado, el agregado de tau induce más tau agregación via cambio conformacional con plantilla4.
Según esta hipótesis, terapias capaces de interrumpir tau siembra podrían ralentizar o invertir el curso de la enfermedad neurodegenerativa tau-mediada. En apoyo de esto, ratones susceptibles a tauopathy de mutación genética y pasivo inyectado con anticuerpos anti-tau Mostrar patología tau reducido y mejora la función cognitiva5,6,7,8 ,9. Sin embargo, los mecanismos por el cual los anticuerpos terapéuticos reducen patología sigue siendo esquivos.
Uno de los mecanismos propuestos es anticuerpo-mediada de la absorción y separación de formas agregadas patológicas de tau por microglía, las células inmunes residentes del cerebro. Publicaciones recientes sugieren que la microglia eficientemente puede internalizar y degradar la especie patológica tau y esta capacidad se ve reforzada por anticuerpos anti-tau a través de una Fc-dependiente mecanismo implicando receptores Fc expresados sobre la superficie de microglía y receptor mediaron fagocitosis10,11. Estos datos identifican microglia como importantes generadores de anticuerpos terapéuticos.
Describimos adjunto un ensayo basado en células para evaluar cuantitativamente la absorción tau por microglia. Datos generados con este análisis pueden ayudar a dilucidar los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-tau lo que representa una herramienta útil para avanzar en los anticuerpos anti-tau para pasos posteriores de su desarrollo como tratamiento potencial del anuncio.
Microglia, las células inmunes del cerebro residente, han sido recientemente identificados como jugadores importantes en los enfoques terapéuticos anticuerpo-mediada de Tauopatías10,11. Separación de tau anticuerpo-mediada por microglía, junto con bloqueo de la captación neuronal9, inhibición o desestabilización de fibrilla formación13,14 y separación de las fibrillas intraneuronales vía los lisosomales camino15, podría contribuir a la eficacia de los anticuerpos anti-tau observada en modelo de ratón de tauopathy5,6,7,8,9.
Describimos aquí un ensayo basado en células para evaluar cuantitativamente la absorción tau por microglia con el objetivo de crear una herramienta de investigación para caracterizar mejor los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-tau.
Este test, adaptado de Funk et al. 11, utiliza células BV-2, que son las células microgliales murinas inmortalizado. Mientras que totalmente no pueden compararse a las células microgliales primaria, cuentan con muchas de las características de microglia primaria, incluyendo la capacidad de contundencia fagocitar Aβ y tau fibrillas11,16,17 ,18,19. Por otra parte, mostraron un comportamiento reproducible en vitro que hacía muy conveniente para el desarrollo de ensayos y estudios cuantitativos, que requieren mínima variabilidad experimental. Al lado de esto, líneas celulares inmortalizadas permiten un mayor rendimiento de ensayo y eliminan la necesidad de sacrificio de animales en comparación con el uso de microglia primaria.
Los agregados de tau que se utilizó en este análisis fueron obtenidos usando el procedimiento de agregación altamente reproducibles en vitro que recientemente descrito13y mostrar morfología similar a emparejado filamentos helicoidales (PHFs) aislados de cerebros de AD pacientes. Si bien no observamos ninguna resultados inesperados que podrían haber sido causados por agregados de tau adherencia a las superficies de plástico o vidrio, el uso de agregados de tau estable y bien caracterizado desempeñó un papel crucial en la reproducibilidad de este ensayo.
Otro aspecto que contribuyó significativamente a la reproducibilidad del análisis fue la densidad celular. El número de células por pozo que se describe en el protocolo representa la densidad celular óptima en las condiciones descritas.
Diferentemente de lo que Funk et al. 11 descrito, etiquetamos agregados de tau con un colorante sensible de pH que aumenta significativamente su fluorescencia sobre internalización en organelos ácidos, lo que permite cuantificación intracelular. Esto, junto con la digestión de la tripsina de superficie límite immunocomplexes o tau, garantías que señal de fluorescencia se mide por citometría de flujo es el resultado de la absorción de tau en lugar de unión a la superficie celular. Además, el uso de una facilita de tinte sensible de pH límite de detección de agregados de tau internalizada en los experimentos de microscopia sin la necesidad de digerir la superficie agregados de immunocomplexes/tau que luego requiere de células re-galjanoplastia y la recuperación.
Usando un tinte altamente selectivo para organelos ácidos en nuestros experimentos de microscopía que nos permitieron no sólo confirmar anticuerpo-mediada, asimismo optimizada la lectura microscopía de nuestro análisis, en comparación con lo que ha sido previamente descrito11 absorción de TAU, sino también de localización de agregados de tau en el compartimiento de endolysosomal.
El análisis que desarrollamos, tiene especificidad óptima que resulta en una buena ventana experimental que permite una separación fuerte entre muestras positivas y negativas. Curiosamente, el ensayo indirectamente detecta diferencias en la afinidad de anticuerpos, lo que representa una poderosa herramienta para el estudio de funciones efectoras de los anticuerpos anti-tau.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Alberto Carpinteiro Soares por su valiosa asistencia técnica.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |