Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

1. BV-2 cellen cultuur Opmerking: Handvat BV-2 cellen onder insluiting van bioveiligheid niveau 2. De BV-2 cellijn produceert een omhuld recombinante ecotropic retrovirus (staat alleen lymfkliertest cellen infecteren)12; deze virussen zijn gekend voor hun in vitro transformeren vermogen en in vivo tumorigene potentieel. Cultuur BV-2 cellen in hoge glucose Dulbecco bewerkt eagle medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM L-Glutamine (hierna aangeduid als kweken medium voortaan) door het zaaien van de cellen op de 4 x 104 cellen/mL. Handhaven van culturen in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.Opmerking: de cellen groeien losjes verbonden en in suspensie. 2. label recombinante Tau aggregaten met pH-gevoelige fluorescente kleurstof Opmerking: Tau aggregaten waren voorbereid zoals beschreven in Apetri et al. 13 met het verschil dat er geen Thioflavin T (ThT) werd toegevoegd aan de buffer van de reactie. Geaggregeerde monsters werden verzameld in 1,5 mL centrifuge buizen. Definitieve fluorescentie signaal werd gecontroleerd door het mengen van 118 µL van het monster zwembad met 12 µL van een 50 µM ThT oplossing. Aggregaten werden gescheiden door centrifugering van het reactiemengsel aggregatie bij 20.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie werd geanalyseerd door SEC-MALS te bevestigen dat alle het monomeer tau werd omgebouwd tot aggregaten. Pellets (tau aggregaten) waren module bevroren en opgeslagen in een diepvriezer op-80 ° C. Resuspendeer tau aggregaten in 0,1 M natriumbicarbonaat buffer (NaHCO3) bij een pH 8,5 tot een concentratie van 1 mg/mL (~ 20 µM).Opmerking: Concentratie van tau aggregaten is gebaseerd op de oorspronkelijke monomeren concentratie zoals beoordeeld door de absorptie van tau monomeren op 280 nm met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 0.31 mLmg-1cm-1. Bewerk ultrasone trillingen ten de geresuspendeerde aggregaten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs te vermijden oververhit. Gebruik een amplitude van 65% (met ultrasoonapparaat van macht 250 W). Uitvoeren van 8 pulsen van 3 s met pauzes van 15 s tussen peulvruchten te voorkomen oververhitting. Bereiden een 8.9 mM stockoplossing van pH-gevoelige kleurstof (voortaan verwijzing naar als pH kleurstof) in dimethylsulfoxide (DMSO) volgens instructies van de fabrikant.Opmerking: Altijd bereid een vers-oplossing en gebruik het alleen op de dag dat zij bereid is. 10 mol kleurstof per mol van eiwit toevoegen aan een definitieve kleurstof concentratie van 0,2 mM. Meng door zachtjes op en neer pipetteren. Incubeer het reactiemengsel gedurende 45 – 60 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. In de tussentijd, monteren een kruislings gekoppelde dextran gel ontzouten kolom volgens de instructies van de fabrikant. De kolom met 25 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO equilibreer. Gooi de stroom door. Het product van de tau aggregaat labeling reactie op de kolom in een totaal volume van 2.5 mL toevoegen. Als het monster minder dan 2,5 mL is, voeg toe buffer tot een totaal volume van 2.5 mL wordt bereikt. Laat het monster volledig invoeren van het verpakte gel, negeren de doorstroming. Elueer met 3,5 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO en verzamelen van het eluaat in 4 gelijkwaardige breuken in 2 mL tubes. Bepalen eiwit concentraties van de 4 breuken door bicinchoninic zuur (BCA) assay. De gelabelde proteïne in een vriezer van-20 ° C worden opgeslagen. 3. opname Assay met fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS) uitlezing Dag 1 – zaad de cellen Wash BV-2 cellen in de kolf doordat kweken van middellange en toevoegen 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).Opmerking: Wassen volume zal variëren afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, wassen met 10 mL 1 x PBS. Verwijderen van PBS van de kolf en losmaken van cellen door broeden met trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 0,05% bij 37 ° C en 5% CO2 , totdat de cellen van de kolf (ongeveer 5 min loskoppelen).Opmerking: Volume van trypsine-EDTA 0,05% afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 2 mL trypsine-EDTA 0,05%. Resuspendeer de cellen in het kweken van medium door pipetteren boven en beneden drie tot vijf keer.Opmerking: Volume van medium kweken is afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt en dus het totale aantal cellen in de kolf. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 8 mL medium kweken. Cellen tellen en maak een celsuspensie met een eindconcentratie van 1 x 105 cellen/mL in kweekmedium dat 200 μg/mL heparine. Plaat 250 µL celsuspensie (2.5 x 104 cellen) per putje in een 96-Wells weefselkweek platte bodemplaat. Incubeer plaat ‘s nachts bij 37 ° C en 5% CO2. Dag 1 – voorbereiding Immunocomplexes Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs. Bereiden 65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in serumvrij medium (SFM) (hoge glucose DMEM aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 200 µg/mL van heparine). Maak de verdunningen van het antilichaam in 65 µl van SFM en bij een concentratie dubbele degene definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C. Dag 2 – Immunocomplexes opname Verwijder kweken medium uit BV-2 cellen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS. Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Verwijder het medium van de incubatie van de cellen en verwerpen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS. 1 x PBS verwijderen en behandelen van cellen met 50 µL trypsine-EDTA 0,25% gedurende 20 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Voeg 200 µL van kweken medium en resuspendeer goed door pipetteren omhoog en omlaag als u wilt loskoppelen van de cellen. Cellen overbrengen in een 96-Wells U-bodem plaat. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zet de plaat in de ijskast, verwijder kweken van middellange en wassen cellen tweemaal door het resuspending van de cel pellets in 150 µL ijs koud 1 x PBS. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Cellen zetten ijs, toegevoegde 1 x PBS en wassen hen door resuspending pellets in 150 µL koude FACS buffer (1 x PBS, 0,5% bovien serumalbumine (BSA), 2 mM EDTA) cellen verwijderen. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Cellen op ijs zet, verwijderen van toegevoegde FACS buffer en resuspendeer de cellen in 200 µL koude FACS buffer. Analyseren van monsters onmiddellijk door FACS verwerven van 2 x 104 gebeurtenissen in de levende cellen poort (zie stap 4.1). 4. FACS analyse Nota: Verwijs naar Figuur 1 voor de gating strategie. Met behulp van de voorwaartse scatter-gebied (FSC-A) versus kant gebied (WS-A) dichtheid scatterplot, gate op levende cellen door met uitzondering van evenementen met lagere niveaus van de voorwaartse scatter (dat wil zeggen, vuil en dode cellen). Binnen de levende cel bevolking, gebruik FSC-A tegenover doorsturen scatter hoogte (FSC-H) mobiele paren en aggregaten uit te sluiten. Dit is de singlet-poort. Met de gebeurtenissen in de singlet-poort, genereren een pH kleurstof enkele parameter histogram. Bepalen gemiddelde fluorescentie intensiteit. Vast percentage pH kleurstof-tau positieve cellen door met uitzondering van de negatieve cellen als bepaald met behulp van het enige besturingselement BV-2. 5. Immunocomplexes opname met microscopie uitlezing Dag 1 – zaad de cellen Bereiden BV-2 cellen zoals beschreven in stappen 3.1.1, 3.1.2 en 3.1.3. Cellen tellen en resuspendeer hen in het kweken van middellange tot een eindconcentratie van 104 cellen/mL. Plaat met 150 µL celsuspensie (1,5 x 103) per putje in een poly-D-Lysine gecoat 96-Wells zwarte plaat met duidelijke vlakke bodem. Incubeer plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur. Dag 3 – opstellen ImmunocomplexesOpmerking: Milde ultrasoonapparaat van gelabelde tau aggregaten vóór incubatie met antilichaam, werd uitgevoerd ter verbetering van de resultaten van de microscopie. Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs. Gebruik een amplitude van 15% (ultrasoonapparaat kracht van 250 W). Uitvoeren van 30 pulsen van 2 s en wacht 20 s tussen pulsen. 65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in SFM voor te bereiden. Verdunde antilichamen in 65 µl van SFM tot een concentratie dubbele definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C. Medium uit cel plaat verwijderen en vervangen met 150 µL van kweken medium aangevuld met 200 µg/mL heparine. Incubeer plaat ‘s nachts bij 37 ° C en 5% CO2. Dag 4-Immunocomplexes opname Kweken medium verwijderen uit de BV-2 cellen. Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 1 uur en 45 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.Vlek celkernen met DNA-specifieke kleurstof en zure organellen met een sonde die selectief lage pH cellulaire compartimenten vlekken. Incubeer de cellen 15 min bij 37 ° C met 5% CO2.Opmerking: Verdun de kleurstoffen in SFM. Live-cel beeldvorming met behulp van een hoog gehalte screening confocal systeem uitvoeren Temperatuur ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Voor afbeeldingen van hoge kwaliteit, gebruik een 63 X water onderdompeling doelstelling en verwerven van 0,5 µm vliegtuigen (20 per Z-stack) per verbeelde veld.