分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング
Summary
マウス副腎の分離、組織を修正、セクション、それらを免疫蛍光染色を実行する方法をご紹介します。
Abstract
蛍光抗体法蛍光色素標識された抗体の雇用組織抗原の検出のための確立された技術、アプリケーションの広範なスペクトルです。抗原の検出は、複数の細胞のタイプの特性と同定のためことができます。副腎腺は発生学的起源の異なる 2 つの異なる組織、腎中間中胚葉由来外側皮質と神経によって構成する内分泌器官、腎臓の上に位置し、間葉系細胞の層でカプセル化された、家紋由来髄質。副腎髄質カテコラミン (アドレナリン、ノルアドレナリン) を生成するのに対し、副腎皮質ステロイド (すなわちミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、性ホルモン) が分泌されます。副腎研究を行いながら、異なる機能を持ったユニークな細胞を区別することが重要です。ここでプロトコルを提供副腎の細胞の種類を特徴付けるため蛍光抗体法の取得に必要な一連のステップのシリーズを説明する私たちの研究室で開発されました。まず、固定、処理およびパラフィン包埋組織の periadrenal 脂肪の微視的除去マウス副腎の解剖に着目します。回転式ミクロトームのティッシュのブロックの区分を述べる。最後に、私たちは最適な信号を達成するために非特異抗体の結合と蛍光の両方を最小限に抑えることを開発した副腎の蛍光汚損のためのプロトコルを詳しく説明します。
Introduction
免疫組織化学は、共役抗体1を検出する後続の染色技術および特定の細胞分子に対する抗体を使って組織のコンポーネントを検出するための手法です。この免疫組織化学プロシージャは、特定の固定を必要とする、特定の抗原のため多くの場合経験的に決定される組織の処理、組織および抗体利用2。固定は、組織とそれによってそのまま携帯および細胞レベル下の構造と発現パターンを維持することの「オリジナル」の状態を維持するために重要です。さらに処理およびプロシージャの埋め込みは、薄切り免疫組織学的研究に使用される区分のために組織を準備する必要があります。
免疫染色は発色や蛍光検出を実行できます。発色検出には、水溶性の基質を不溶性の着色された製品に変換する酵素の利用が必要です。この酵素は、抗体 (一次抗体) の抗原を認識する共役することができます、(すなわち、二次抗体) の一次抗体を認識する抗体にはそれをより頻繁に活用します。この手法は非常に敏感です。あるの酵素反応から生じる色の製品は、イメージングのため明視野顕微鏡だけを必要とします。ただし、共存して、1 つの色の沈着は他の 1 つの沈着を隠すことができるので 2 つのタンパク質を視覚化しようとしたとき、発色染色は適切なできません。共同染色の場合蛍光がより有利であると証明しました。蛍光抗体法の出現はアルバート ・ クーンズと付いている蛍光抗体と組織抗原を識別し、紫外光3下の断面組織でそれらを表示するシステムを開発した同僚に起因します。蛍光は励起後の光を発する蛍光体と共役抗体に基づいています。(No か少しオーバー ラップ) と異なる波長での排出量といくつか fluorophores が存在するため、この検出方法は複数のタンパク質の研究に最適です。
副腎は腎臓の上にあるし、間葉系の被膜に囲まれた 2 つの発生のコンポーネントによって特徴付けられる一対の臓器です。内側の髄質は、神経堤に由来はドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどのカテコールアミンを作り出す間、雌雄の中間中胚葉由来、外の副腎皮質はステロイド ホルモンを分泌します。副腎皮質は, 組織学的および機能的で分けられる各ゾーンの異なるクラスのステロイド ホルモンを分泌、3 つの同心円ゾーン: 外側球状 (zG) 生成ミネラルコルチコイド電解質の恒常性を調節して血管内ボリューム中間ゾナ副腎皮質 (zF)、直接、zG 下を; 血糖を増加するエネルギー店の動員を介してストレス反応を仲介するグルココルチコイドを分泌します。内部網状 (zR) を合成するセックス ステロイド前駆体 (すなわち,デヒドロエピアンドロステロン (DHEAS))4。
種間副腎皮質帯状のいくつかのバリエーションがある: 例えば、ハツカネズミは、zR を欠いています。M. 毛様体筋のユニークな生後 X ゾーンは、好酸性細胞質5小さな脂質に乏しい細胞によって特徴付けられる胎児の大脳皮質の残骸です。X ゾーンは思春期の雄マウスと妊娠の最初のメスのマウスの後に消えるかない繁殖雌6,7で徐々 に退化。また、蛇行と zG 展示物の厚さは、末梢幹・前駆細胞の組織が、zG に隣接すると種の間の変化をマークしました。他の齧歯類とは異なり、ラットは zG と zF の間目に見える未分化ゾーン (zU) 幹細胞ゾーンおよび/または一時的な前駆細胞の増幅のゾーンとして機能します。ZU はラットに固有またはより単に目立つように組織的な細胞群かどうかは不明な8,9です。
副腎皮質の細胞には、すべてのステロイド ホルモン10,11の前駆体としてコレステロールエステルを格納する脂肪滴が含まれています。 「妊」という用語は、コレステロールを介して一連のステロイド産生因子 1 (SF1) 式はステロイド ホルモン産生の潜在的なマーカー活動を含む酵素反応からのステロイド ホルモン生産プロセスを定義します。副腎、Sf1 式は12の皮質の細胞にのみ存在です。興味深い研究は、副腎皮質ステロイド ホルモン産生の潜在的な13セルにおける内因性ビオチンの式を発見しました。この特性をステロイド産生を区別するためにも用いることができるこれがビオチンとストレプトアビジンに基づく染色法、内因性ビオチンとストレプトアビジン、抱合抗体による検出のための高い背景の原因になります。他のと内にある、副腎、すなわち、内皮細胞、莢膜、髄質細胞の集団からの細胞。
交感神経節前ニューロンによって支配されている、副腎髄質は、エピネフリンとノルエピネフリンを含む粒状の細胞質で好塩基性細胞によって特徴付けられます。髄質細胞酸化14後茶色の色素を形成するカテコールアミン含有量が高いため「髄質」と呼びます。チロシンヒドロキシラーゼ (TH) は、カテコールアミンの合成、および副腎の律速段階を触媒する、延髄15でのみ表される酵素です。
ここでマウス副腎、パラフィンと区分、および蛍光抗体法を構成する細胞の種類を識別するために副腎のセクションに染色を実行するメソッド内に埋め込むための処理の隔離のためのプロトコルを提案する、副腎皮質と髄質。このプロトコルは、定期的に本研究で使用される複数の抗体を用いた免疫染色の研究室で標準です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、準備とともにマウス副腎の分離およびパラフィン包埋切片のマウス副腎の染色方法について説明します。
我々 がテストした他のプロトコルと比較して、この蛍光プロトコルは当研究室で使用される抗体の大部分に適して証明されています。しかし、特定のケースでそれは染色の結果を改善するためにいくつかの調整を必要があります。簡単に変更?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は彼の有用な提案およびこのプロトコルの確立でテクニカル サポートを博士モハマド ズバイルをありがちましょう。この作品は、国立糖尿病・消化器病・腎臓病、健康研究助成の国立機関 2R01-DK062027 (G.D.H) にによって支えられました。
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
Referencias
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