Summary

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Published: December 14, 2018
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Summary

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Abstract

Erythroiden Zelle Engagement und Differenzierung fahren Sie durch Aktivierung eines Linie beschränkt transkriptionelle Netzwerks orchestriert von einer Gruppe von Zellen Schicksal bestimmen und Reifung Faktoren. Wir wollten früher minimalen Voraussetzungen für die Instruktion der roten Blutkörperchen Entwicklung mit direkten Abstammung Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte erythroiden Vorläuferzellen/Vorstufen (iEPs) definieren. Wir haben gezeigt, dass Überexpression des Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc (GTLM) können schnell konvertieren murinen und menschlichen Fibroblasten direkt zu iEPs, die Bona Fide erythroiden Zellen im Hinblick auf Morphologie, ähneln Phänotyp, und Genexpression. Wir beabsichtigen, dass iEPs ein wertvolles Instrument zur Regulierung der Erythropoese und Zelle Schicksal zu studieren liefern. Hier beschreiben wir den schrittweisen Prozess der Umwandlung murinen Schweif Tipp Fibroblasten in iEPs über Transkription Faktor-driven direkten Abstammung Neuprogrammierung (DLR). In diesem Beispiel führen wir die Umprogrammierung in Fibroblasten von erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse, die das gelbe fluoreszierende Protein (YFP) unter der Kontrolle der Erythropoietin-Rezeptor gen (EpoR) Promotor, ermöglicht die Visualisierung der erythroiden Zelle ausdrücken Schicksal Induktion bei der Umprogrammierung. Nach diesem Protokoll können innerhalb von fünf bis acht Tagen Fibroblasten in iEPs umprogrammiert werden.

Während noch der Prozess verbessert werden kann, zeigen wir, dass Umprogrammierung GTLM vermittelt einen schnellen und direkten Prozess nachgeben Zellen mit Eigenschaften der Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen.

Introduction

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sind unverzichtbar bei allen Wirbeltieren und 84 % aller Zellen des menschlichen Körpers1ausmachen. Aus embryonalen ins Erwachsenenleben hängt unsere Gesundheit stark genaue Regelung der RBC Homöostase. Die laufende Produktion der Reifen Erythrozyten während der gesamten Entwicklung bis ins Erwachsenenalter wird als Erythropoese bezeichnet. Eine große Herausforderung in der Erythropoese Forschung ist die master Regler definieren, die RBC-Entwicklung und der Wechsel zwischen primitiven und endgültige Erythropoese zu orchestrieren. Direkte Linie Umprogrammierung der erythroiden Vorläuferzellen bietet die Möglichkeit, weitere erythroiden Entwicklung in Vivozu verstehen.

Direkte Linie Neuprogrammierung (DLR), auch bekannt als Transdifferenzierung, ist der Prozess der Umprogrammierung ein Zelltyp direkt ineinander pluripotenten und multipotenten Vorläuferzellen Phasen umgehen. DLR wurde bisher zur zahlreichen Zelltypen, einschließlich neural2, hämatopoetischen3,4,5, hepatische6 und nephrotisches7, Vorläuferzellen zu produzieren. Für Entwicklungs Biologen geworden DLR ein wichtiges Instrument zur abfragenden Aspekte der Linie Engagement und terminal Differenzierung Prozesse8,9. DLR ergänzen und teilweise ersetzen in Vivo Studien für Verständnis Mechanismen der Zelle Schicksal bestimmenden Faktoren bei der Entwicklung. Das DLR-Protokoll für die Umprogrammierung zu erythroiden Vorläuferzellen, die in diesem Dokument beschriebenen bietet Bereich eine kostenlose Methode für Studien der Erythropoese.

Wir haben bereits gezeigt, dass Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ausreichend reprogram murine und menschlichen Fibroblasten direkt an induzierte erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) 10. the GTLM umprogrammiert erythroiden Zellen ähneln stark Bona Fide primitive erythroiden Vorläuferzellen im Hinblick auf Morphologie, Phänotyp und gen Ausdruck10. So iEPs haben eine begrenzte Verbreitung Kapazität und Reifen zu kernhaltigen Erythrozyten ähnlich vorübergehend im frühen Embryo vor Beginn der endgültigen Erythropoese. Durch Änderungen in der Neuprogrammierung Bedingungen (z. B. Punktmutationen in Umprogrammierung Faktoren oder Zugabe von anderen Faktoren), kann man verstehen, wie dies zu Veränderungen in der erythroiden Entwicklung und Differenzierung führt. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass die Zugabe von Klf1 oder Myb GTLM Cocktail das Globin Expressionsmuster von überwiegend embryonalen (primitiv) verändert, vor allem Erwachsene (definitive). Dieser Befund bestätigt die Gültigkeit der mit DLR als Werkzeug zur Definition Entwicklungsfaktoren im Erythropoese.

Hier beschreiben wir den Prozess iEPs aus Maus Schweif Tipp Fibroblasten (TTF) zu erzeugen. In unseren repräsentativen Ergebnissen führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor– Cre R26– eYFP) Zellen, die das gelbe fluoreszierende Protein (eYFP) aus den Rosa26 Locus in allen Ausdrücken den Erythropoietin-Rezeptor, ermöglicht einfache Visualisierung des Engagements für die erythroiden Linie ausgedrückt haben. Mit dieser Methode sind bereits fünf Tage nach Transduktion YFP positivere (EpoR +) Zellen vorhanden. Dieses Protokoll bietet daher eine schnelle und robuste Technik für die Generation der erythroiden Vorläuferzellen in Vitro.

Protocol

1. Aufbau und die Pflege der primäre Maustaste Tail Tip Fibroblast Kulturen Bereiten Sie Gelatine beschichtet Gerichte (empfehlen einen 10 cm Teller für ein Tail) durch Abdecken der Oberfläche mit 0,1 % Gelatine und Inkubation der Gerichte für ca. 20 min bei 37 ° C. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung aus der Schale und mindestens 2 Stunden trocknen lassen. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Entfernen Sie die Rute mit einer Schere, Schnitt an der Unterseite der Rute. Setzen Sie…

Representative Results

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Protokoll zur Herstellung von iEPs von Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven DLR. Wir bewerten die Zelle Neuprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, koloniebildenden Assays und gen Expressionsanalyse. Um die Visualisierung der Konvertierung erythroiden Zelle Schicksal zu unterstützen, führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26-…

Discussion

Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ist ausreichend, um murinen und menschlichen Fibroblasten direkt an iEPs10neu zu programmieren. Die umprogrammierten erythroiden Zellen ähnelte stark Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen hinsichtlich Morphologie, Phänotyp, Genexpression und koloniebildenden Fähigkeit. Dieser Befund bestätigt die B…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Evelyn Wang und Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) für das Klonen und Harvey Lodish (Whitehead Institut) für die Bereitstellung vieler der Plasmide, die für die Generierung der retroviralen Bibliothek verwendet. Wir danken Kavitha Siva und Sofie Singbrant (Abteilung für Molekularmedizin und Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson und Shamit Soneji (Abteilung für molekulare Hämatologie, Universität Lund) für ihre Rolle bei der Beschreibung des iEP Produktion. Wir würden auch gerne anerkennen und danke Julian Pulecio (Zentrum für Regenerationsmedizin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent Institute of Medical Research und Departement für Medizin, St. Vincent Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanische Institution für Forschung und Weiterbildung, Barcelona) und Vijay G. Sankaran (Broad Institute des Massachusetts Institute of Technology und Harvard, Cambridge ) für ihre bisherigen Beiträge zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Ragnar Söderberg Stiftung (j.f.); die Swedish Research Council (, j.f.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (, j.f.); die schwedische Stiftung für strategische Forschung (, j.f.); Åke Wiberg Stiftung (j.f.); ein Marie Curie Integration Stipendium (j.f.).

Materials

DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

Referencias

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Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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