نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).
الجبيلة هي العضيات في النباتات الخضراء المسؤولة عن القيام بالعديد من الأيضية الأساسية، أبرزها عملية التمثيل الضوئي. ضمن المعايشة، النظام غشاء ثايلاكويد يضم جميع أصباغ التمثيل الضوئي ومجمعات مركز رد الفعل، ومعظم حاملات الإلكترون، وهي مسؤولة عن توليف ATP تعتمد على الضوء. أكثر من 90% بروتينات بلاستيدات الخضراء المشفرة في النواة ومترجمة في سيتوسول واستيرادها فيما بعد إلى بلاستيدات الخضراء. زيادة البروتين النقل إلى أو عبر غشاء ثايلاكويد يستخدم واحد من أربعة مسارات إزفاء. هنا، يمكننا وصف أسلوب عالية الغلة لعزل ثيلاكويدس النقل المختصة من البازلاء (بيسوم Pisum)، جنبا إلى جنب مع فحوصات النقل خلال الثلاث تعتمد على الطاقة كبتات و cpSec1، وكبسرب بوساطة مسارات. هذه الأساليب تمكن التجارب المتصلة بالتعريب البروتين ثايلاكويد وعلم الطاقة النقل آليات إزفاء البروتين عبر الأغشية البيولوجية.
يجب أن يكون ترانسلوكاتيد ما يقرب من جميع البروتينية الآلية المسؤولة عن وظيفة بلاستيدات الخضراء المناسبة من سيتوسول1. في المغلفات بلاستيدات الخضراء، يتم استيراد ركائز البروتين من خلال ترانسلوكون الغشاء الخارجي (TOC) وترانسلوكون من الغشاء الداخلي (عرة)2. مواصلة استهداف ثايلاكويد غشاء والتجويف يحدث خلال إزفاء (كتات) ارجينين التوأم3و الافرازية (cpSec1)4، إشارة اعتراف الجسيمات (كبسرب)5ومسارات الإدراج التلقائي6 . طريقة لعزل عالية الغلة المعايشة النشطة فسيولوجيا والأغشية ثايلاكويد ضروري لقياس علم الطاقة وحركية الحدث إزفاء، فهم آليات النقل المتنوعة في كل مسار، وتعريب بروتين معين الركيزة لمصلحة أي من المقصورات متميزة ستة من بلاستيدات الخضراء.
عزل أغشية من بلاستيدات الخضراء عروض أفضل التجريبية السيطرة على العوامل البيئية (مثل تركيزات الملح والركيزة، ووجود ATP/غتب، وظروف الأس الهيدروجيني) التي تؤثر على قياس النقل علم الطاقة و حركية. هذه البيئة في المختبر يفسح المجال لاستكشاف تفاصيل إزفاء آليا لنفس الأسباب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تحسنت البرمجيات التنبؤية لتعريب بروتينات بلاستيدات الخضراء7،8، في المختبر فحوصات النقل توفر طريقة أسرع لتأكيد عبر فحوصات الفلورسنت المستندة إلى الفحص المجهري أن تتطلب علامة نيون وراثيا مرمزة، تحول النباتات و/أو أجسام مضادة محددة. نقدم هنا، بروتوكولات للعزلة بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد من البازلاء (بيسوم بسام)، وكذلك لفحوصات النقل الأمثل لكل من المسارات إزفاء ثايلاكويد المعتمدة على الطاقة.
عزل بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد
يمكن أن يؤدي إلى الكسر المفرط في بلاستيدات الخضراء الفقراء العزل ومن ثم ثايلاكويد الفقيرة تسفر عن بعد الانفصال في التدرج. فمن الأفضل مجانسة الأنسجة المقطوع بلطف بضمان أن جميع المواد هي غارقة قبل المزج والنبض في 15 ثانية دورات حتى تجانس تماما. …
The authors have nothing to disclose.
وقد أعدت هذه المخطوطة مع التمويل من شعبة العلوم الكيميائية وعلوم الأرض، والعلوم البيولوجية، مكتب 408 من علوم الطاقة الأساسية “إدارة الطاقة الأمريكية” عن طريق المنح دي-SC0017035
Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |