Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía
Summary
Presentamos aquí protocolos de aislamiento de alto rendimiento de tilacoides fisiológicamente activos y análisis de transporte de proteínas para el cloroplasto doble arginina desplazamiento (cpTat), secretoras (cpSec1) y vías de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal.
Abstract
Cloroplastos son los organelos en las plantas verdes encargadas de numerosas vías metabólicas esenciales, principalmente la fotosíntesis. Dentro de los cloroplastos, el sistema de membranas del thylakoid alberga todos los pigmentos fotosintéticos, complejos de centro de reacción y la mayoría de los portadores del electrón y es responsable de la síntesis de ATP dependiente de la luz. Más del 90% de las proteínas del cloroplasto son codificado en el núcleo, traducido en el citosol y posteriormente importado en el cloroplasto. Transporte de proteína posterior en o a través de la membrana del thylakoid utiliza uno de cuatro vías de desplazamiento. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el aislamiento de transporte competentes tilacoides de guisantes (Pisum sativum), junto con ensayos de transporte a través de las tres dependientes de la energía cpTat, cpSec1 y las vías mediada por cpSRP. Estos métodos permiten experimentos relativos a la localización de la proteína de tilacoides, energética del transporte y los mecanismos de translocación de la proteína a través de las membranas biológicas.
Introduction
Casi toda la maquinaria proteica responsable de cloroplasto adecuada función debe translocado desde el citosol1. En los sobres de cloroplasto, sustratos de proteína son importados a través del translocon de la membrana externa (TOC) y el translocon del membrana interna (TIC)2. Mayor orientación a los tilacoides membrana y lumen se produce a través de la doble arginina desplazamiento (cpTat)3, los secretores (cpSec1)4, el de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal5y las vías de inserción espontánea6 . Un método para el aislamiento de alto rendimiento de cloroplastos fisiológicamente activos y tilacoides es necesario medir la energía y cinética de un evento de desplazamiento, para comprender los mecanismos de transporte diferentes en cada itinerario y para localizar un sustrato de proteína particular de interés para cualquiera de los seis distintos compartimentos del cloroplasto.
El aislamiento de las membranas del cloroplasto ofrece mejor control experimental de factores ambientales (como las concentraciones de sal y el sustrato, la presencia de ATP/GTP y las condiciones de pH) que afectan la medición de la energía de transporte y cinética. Este entorno en vitro se presta a la exploración de los detalles mecanicistas de desplazamiento por las mismas razones. Además, aunque software predictivo para la localización de las proteínas del cloroplasto ha mejorado7,8, en vitro ensayos de transporte proporcionan un método más rápido para la confirmación sobre ensayos de microscopia fluorescentes requieren una etiqueta fluorescente genéticamente codificada, planta de transformación o anticuerpos específicos. Aquí, presentamos protocolos para aislamientos cloroplasto y tilacoides de guisantes (Pisum sativum), así como para ensayos de transporte optimizados para cada una de las vías de desplazamiento de tilacoides dependiente de energía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aislamiento del cloroplasto y tilacoides
Rotura excesiva puede resultar en cloroplasto pobre aislamiento y así tilacoides pobre rendimiento después de la separación del gradiente. Es mejor homogeneizar el tejido cosechado suavemente asegurándose de que todo el material es sumergido antes de licuar y pulso en 15 ciclos de s hasta completamente homogeneizada. Si es necesario, utilice múltiples rondas más cortas de la mezcla con menos tejido en cada ronda.
Todos los…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue elaborado con fondos de la división de ciencias químicas, Geociencias y biociencias, oficina 408, de ciencias básicas de la energía del Departamento de energía a través de Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referencias
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Bioquímica. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
