Summary

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Published: November 09, 2018
doi:

Summary

여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

Abstract

Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.

Introduction

Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 , 12, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근11,12,13,,1415에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.

Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐23에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.

현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.

Protocol

동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다. 1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비 BALF 컬렉션 케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사 기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버…

Representative Results

마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속. <p class="j…

Discussion

지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30</s…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.

Materials

Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

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Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

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