Summary

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Published: September 13, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Abstract

Interferencia de RNA – y genoma de edición basados en plataformas de detección han sido ampliamente utilizados para identificar los factores de la célula huésped que limitan la replicación del virus. Sin embargo, estas pantallas se realizan normalmente en las células que son naturalmente permisivas al patógeno viral bajo estudio. Por lo tanto, la sólida réplica de virus en condiciones de control puede limitar el rango dinámico de estas pantallas. Además, estas pantallas no puede identificar fácilmente las vías de defensa celular que limitan la replicación del virus si el virus es capaz de contrarrestar las defensas antivirales y bien adaptado al host. En este artículo, describimos un nuevo paradigma para explorar interacciones virus-huésped mediante el uso de pantallas que a abortado naturalmente infecciones por arbovirus como el virus de la estomatitis vesicular (VSV). A pesar de la capacidad de VSV para replicar en una amplia gama de insecto díptero y anfitriones mamíferos, VSV experimenta una infección abortiva post entrada en una variedad de líneas celulares derivadas de insectos lepidópteros, como la polilla gitana (Monacha anaerobias). Sin embargo, estas infecciones abortivas de VSV pueden ser “rescatadas” cuando las defensas antivirales de la célula anfitrión están en peligro. Describimos cómo VSV cepas codificación genes del reportero conveniente y restrictivas dispar L. líneas celulares pueden ser asociadas a las pantallas de configuración para identificar factores de host involucrados en la restricción de arbovirus. Además, también mostramos la utilidad de estas herramientas de investigación en la identificación de factores codificados viralmente que rescatar replicación VSV durante la coinfección o a través de la expresión ectópica, las codificadas por los virus de mamíferos incluidas. La restricción natural de replicación de VSV en dispar L. células proporciona una alta relación señal a ruido cuando la detección de las condiciones que promueven el rescate VSV, permitiendo el uso de simplista luminiscencia y fluorescencia-ensayos para controlar los cambios en la replicación del VSV. Estas metodologías son valiosas para la comprensión de la interrelación entre respuestas antivirales del huésped y factores de evasión inmune viral.

Introduction

La capacidad de un virus para replicar productivamente en un anfitrión particular se rige en parte por la disponibilidad de factores de la célula huésped que admiten entrada viral y replicación1. La gama de virus también puede ser dictada por la capacidad de un virus a contador celular antiviral las defensas que de lo contrario impediría la replicación viral2,3. Es el resultado de estas interacciones virus-huésped complejos que en última instancia decide si un virus será capaz de completar su ciclo de vida en un anfitrión particular. Dadas las consecuencias potencialmente patógenas para el host si sobreviene la replicación viral, es fundamental para el desarrollo de estrategias experimentales para mejorar nuestra comprensión de las interacciones virus-huésped claves que pueden inclinar la balanza entre abortivos y productivo infecciones. Dilucidar las características moleculares de la interacción virus-huésped será instrumental en el desarrollo de estrategias terapéuticas antivirales nuevos y alternativos.

Con el advenimiento del RNA de interferencia (ARNi)4,5 y herramientas de edición de genoma (e.g., CRISPR Cas9, Zinc finger nucleasas, TALENs)6,7, se ha convertido en experimentalmente factible modificar el expresión de factores celulares de todo el genoma de escalas y explorar el impacto de estas alteraciones en la replicación del virus. De hecho, se han realizado numerosos ARNi y genoma de edición basado en pantallas en tipos de la célula huésped invertebrados y vertebrados que han dado a conocer nuevas facetas de interacción virus-huésped8,9,10, 11 , 12. estas pantallas suelen emplean virus codificación reporteros, como luciferasa de luciérnaga (LUC) o proteínas fluorescentes (e.g., GFP, DsRed), que proporcionan medios convenientes de evaluar cuantitativamente la expresión viral del gene como una lectura para la replicación viral9,12. Esta estrategia permite a los investigadores a identificar los factores de huésped que sea promoverán o antagonizan la replicación viral como lo demuestran los aumentos o disminuciones, respectivamente, en reportero viral señales9,12. Sin embargo, en la mayoría de los casos, estas pantallas se han realizado utilizando virus que están bien adaptadas para el tipo de célula de host en el que se están estudiando. Mientras que esta estrategia puede ser importante para la comprensión de las relaciones coevolutivas entre los patógenos virales y sus anfitriones naturales, existen preocupaciones fundamentales en cuanto a su uso en descubrir factores antivirales de host. En estos casos, una mejora en reporter virus señal sobre RNAi caída está siendo buscada, o la inactivación de un factor celular que normalmente impide la replicación viral. En primer lugar, si un virus ya es capaz de replicar enérgicamente en la célula huésped siendo examinada bajo condiciones de control, el rango dinámico de la pantalla (es decir, la capacidad de distinguir entre fondo y señales mejoradas reportero viral) puede ser limitado. En segundo lugar, este problema se agrava aún más por las situaciones en que el virus está bien adaptada a la célula huésped y eficaz en la lucha contra vías de defensa del anfitrión que se apunta en la pantalla.

Debido a las preocupaciones anteriores sobre interacción virus-huésped tradicionales métodos de cribado, se desarrolló un nuevo paradigma para el estudio de las interacciones virus-host que explotan infecciones del arbovirus naturalmente abortiva en células de los insectos lepidópteros. Esta estrategia deriva de una observación que los arbovirus humanos estudiados, VSV, sufre una infección abortiva en las células derivadas de la polilla gitana (L. anaerobias)13. VSV es transmitido naturalmente por insectos díptero (es decir, moscas de la arena) a los anfitriones mamíferos y se ha demostrado experimentalmente para infectar a una amplia gama de invertebrados y vertebrados hospedadores en celular cultivo e in vivo14. El genoma de ARN monocatenario de 11 kb sentido negativo de VSV codifica cinco mRNAs subgenómico que cada uno se traducen a las proteínas que forman el virión envuelto. Sin embargo, sistemas genéticos inversos VSV han permitido la creación de cepas réplica-competente codificación de LUC o proteínas fluorescentes, además de los cinco naturales VSV gene productos15,16,17. Porque estas proteínas del reportero no se incorporan en el virión VSV, proporcionan una lectura conveniente para la expresión de gene VSV que ocurre post entrada. Utilizando cepas VSV codifican GFP o LUC, previamente hemos demostrado que genes VSV es seriamente restricto a la entrada de las células LD652 y que títulos VSV no aumentan por la infección después de 72 horas (hpi). En contraste, la coinfección de células LD652 con VSV y los mamíferos poxvirus, virus vaccinia (VACV), conduce a aumento logarítmico en la expresión génica VSV y los títulos por este momento. VACV experimenta la expresión temprana de genes, replicación del ADN y tardía expresión génica en las infecciones LD652 de la célula, pero el ciclo de replicación VACV es en última instancia infructuoso debido a virión incompleta morfogénesis18. El genoma de ADN ~ 192 kb grande de VACV codifica proteínas > 200, muchos de los cuales mostrar propiedades inmunomoduladoras que promueven la replicación viral a través de la supresión del anfitrión inmunorespuestas19. Por lo tanto, la hipótesis de que el “rescate” de la replicación de VSV en células LD652 por coinfección VACV fue probablemente mediado por VACV inmunomoduladores que inhibían dispar L. respuestas normalmente restringir la replicación del VSV. En apoyo de esto, el tratamiento de las células LD652 con el inhibidor de host RNA polimerasa II actinomicina D también rescata replicación VSV en células LD652, que indica que las respuestas de acogida dependiente de la transcripción cuadra VSV replicación post entrada13.

Las observaciones anteriores sugieren que la naturaleza naturalmente restrictiva de las células LD652 a la infección de VSV puede proporcionar un fondo relativamente bajo cuando la detección de las condiciones que mejoran las señales reportero VSV-codificado (es decir, los que inhiben la host defensas antivirales). Aquí, ofrecemos los métodos para el uso de fluorescencia o ensayos de LUC a pantalla para condiciones que aliviar la restricción de VSV en células de lepidópteros. En primer lugar, mostramos cómo estos ensayos pueden utilizarse para identificar los factores inmunomoduladores virally codificado que restricción de VSV durante cualquiera de los dos experimentos de coinfección o a través de la expresión ectópica de factores virales candidato. Por ejemplo, ilustramos cómo utilizamos estas técnicas de proyección para identificar poxvirus codifican proteínas de A51R como una nueva familia de factores inmunomoduladores que rescatar replicación de VSV en ausencia de otros factores de poxvirus13. En segundo lugar, ilustramos cómo ARNi en restrictivas VSV-LD652 infecciones de células se puede utilizar para identificar directamente factores eucarióticos host arbovirus restricción13.

Protocol

1. general Monacha dispar (LD652) celular y cultivo de Virus LD652 célula de cultivo y de la galjanoplastia A la cultura dispar L.-derivado de las células LD652, mantener una monocapa de células en un medio de crecimiento (Tabla de materiales) se incubaron a 27 ° C en atmósfera normal. Mantener las células en platos tratados con tejido y cultura de 10 cm y paso de las células al llegar al 80% de confluencia. Para placa, de…

Representative Results

Como ejemplo de células vivas aplicaciones para supervisar el rescate VSV en coinfección VACV, LD652 células fueron plateadas en un pozo de 8 cámara plato y mock-infectados o infectadas con VSV-DsRed (MOI = 1) en la presencia o ausencia de VACV-FL-GFP (MOI = 25). Porque VSV-DsRed expresa DsRed como una proteína libre y no está unido a proteínas estructurales de VSV (figura 1A), sólo se detecta después de inicia de VSV entrada y expresión genética. …

Discussion

Aquí hemos descrito simple fluorescencia y luminiscencia-ensayos para detectar condiciones que rescatar replicación de VSV en cultivos celulares de lepidópteros restrictivas. La infección abortiva de VSV en lepidópteros células crea una excelente relación señal-ruído cuando ensayando para la expresión de gene VSV. Por ejemplo, las señales de LU en lisados de infecciones VSV-LUC solo eran ~ 1,000-fold superior en mock-infectados lisados, pero estas señales solamente cambiaron aproximadamente doble en un transc…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.G. fue apoyado por fondos de programa de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center dotado. Los autores agradecen la disposición de VSV-DsRed y VSV-LUC Michael Whitt (la Universidad de Tennessee Health Science Center) y Sean Whelan (Harvard Medical School). Los autores también agradecen Gary Luker (escuela de medicina de la Universidad de Michigan) el amable don de la cepa VACV-FL-GFP.

Materials

6-well tissue culture plates CELLTREAT 229106
24-well tissue culture plates CELLTREAT 229124
10 cm tissue culture dishes Corning C430167
Grace’s Insect Medium Sigma G8142
EX-CELL 420 Sigma 14420C
Fetal Bovine Serum – Optima Atlanta Biologicals S12450
Growth medium 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) Sigma A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma D8662
Serum Free Media (SFM) Thermo Fisher 10902096
Cytosine arabinoside Sigma C1768
Transfection reagent Thermo Fisher 10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25950CQC
Reporter lysis buffer 5X Promega E3971
Luciferase Assay Reagent Promega E1483
96-Well Microplates Corning 3915
Mouse anti-FLAG antibody Wako 014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody Abcam ab21176
Mouse anti-actin antibody Sigma A2066
Mouse anti-VSV M N/A N/A Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L N/A N/A Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish Lab-Tek II 155409
Cell viability dye Thermo Fisher C12881
FLUOstar microplate reader BMG Labtech FLUOstar
Confocal microscope Olympus FV10i-LIV
Image analysis software Olympus v1.18 cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge Eppendorf 22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System Li-COR Biosciences Odyssey Fc
LD652 cells N/A N/A Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells ATCC CRL-2761
BHK cells ATCC CCL-10
HeLa cells ATCC CCL-2
BSC-1 cells ATCC CCL-26
in vitro transcription and purification kit Thermo Fisher AM1626
PCR purification kit Qiagen 28104

Referencias

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

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Rex, E. A., Seo, D., Gammon, D. B. Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors. J. Vis. Exp. (139), e58244, doi:10.3791/58244 (2018).

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