التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية
Summary
نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.
Abstract
قد استخدمت على نطاق واسع تحديد العوامل الخلية المضيفة التي تقيد النسخ المتماثل الفيروس تدخل الجيش الملكي النيبالي-والجينوم التحرير على أساس فحص الأنظمة الأساسية. ومع ذلك، وهذه الشاشات تجري عادة في الخلايا التي بطبيعة الحال المتساهلة لمسببات المرض الفيروسي قيد الدراسة. ولذلك، النسخ المتماثل قوية من الفيروسات في ظروف السيطرة قد تحد من النطاق الديناميكي لهذه الشاشات. وعلاوة على ذلك، قد تكون هذه الشاشات غير قادر على التعرف بسهولة على مسارات الدفاع الخلوية التي تقيد فيروس النسخ المتماثل إذا كان الفيروس تكييف جيد للبلد المضيف وقادرة على التصدي للدفاعات المضادة للفيروسات. في هذه المقالة، يصف لنا نموذجا جديداً لاستكشاف التفاعلات الفيروس–المضيف عن طريق استخدام شاشات مركز على العدوى وبطبيعة الحال فاشلة قبل سيتناقش مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة). وعلى الرغم من قدرة منظمة للنسخ المتماثل في طائفة واسعة من الحشرات ديبتيران والمضيفين الثدييات، يخضع منظمة عدوى بعد الدخول، وفاشلة في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المستمدة من الحشرات ليبيدوبتيران، مثل العثة الغجرية (Lymantria dispar). ومع ذلك، هذه الالتهابات منظمة فاشلة يمكن أن تكون “إنقاذ” عندما يتم اختراق الدفاعات المضادة للفيروسات الخلايا المضيفة. يصف لنا كيف سلالات منظمة ترميز الجينات مراسل مريحة والتقييدية ديسبار ل. يمكن إقران خطوط الخلايا إلى شاشات الإعداد لتحديد المضيف العوامل الداخلة في تقييد المفصليات. وعلاوة على ذلك، نعرض أيضا أداة أدوات الفحص هذه في تحديد العوامل فيروسي المرمزة أن إنقاذ منظمة النسخ المتماثل أثناء كوينفيكشن أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم، بما في ذلك ترميز بفيروسات الثدييات. تقييد النسخ المتماثل منظمة في الخلايا ديسبار لام الطبيعية توفر نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز منظمة الإنقاذ، مما يتيح استخدام التبسيط التﻷلؤ fluorescence القائم وفحوصات لمراقبة التغييرات في منظمة النسخ المتماثل. هذه المنهجيات قيمة لفهم التفاعل بين المضيف الردود المضادة للفيروسات والعوامل الفيروسية التهرب من الحصانة.
Introduction
قدرة الفيروس على تكرار منتجة في مضيف معين في جزء تحكمها توافر العوامل الخلية المضيفة التي تدعم دخول الفيروسية والنسخ المتماثل1. يمكن أن تمليها مجموعة المضيف الفيروس أيضا قدرة الفيروس للدفاعات المضادة للفيروسات الخلوية العداد بخلاف ذلك من شأنه أن يعرقل النسخ المتماثل الفيروسية2،3. وهو النتيجة لهذه التفاعلات المعقدة الفيروس–المضيف في نهاية المطاف أن تقرر ما إذا كان فيروس سوف تكون قادرة على إكمال دورة الحياة في مضيف معين. نظراً للعواقب المحتملة المسببة للأمراض للمضيف إذا تستتبعه هذه النسخ المتماثل الفيروسية، من الأهمية بمكان وضع استراتيجيات تجريبية لزيادة فهمنا للتفاعلات الرئيسية الفيروسات–المضيف التي يمكن ترجيح كفة الميزان بين فاشل والإنتاجية الالتهابات. توضيح الميزات الجزيئية للفيروس–المضيف التفاعل ستكون مفيدة في وضع الاستراتيجيات العلاجية المضادة للفيروسات الجديدة والبديلة.
مع ظهور الحمض النووي الريبي التدخل ([رني])4،5 وأدوات تحرير الجينوم (مثلاً.، كريسبر-Cas9، والزنك إصبع نوكلياسيس، تالينس)7من6،، فقد أصبح ممكناً تجريبيا لتغيير جداول التعبير عن العوامل الخلوية على نطاق الجينوم واستكشاف أثر هذه التعديلات على فيروس النسخ المتماثل. وفي الواقع، [رني] والجينوم-تحرير-تعتمد شاشات عديدة أجريت في أنواع الخلايا المضيفة اللافقاريات والفقاريات التي قد كشف النقاب عن جوانب جديدة للفيروس–المضيف التفاعلات8،،من910، 11 , 12. عادة ما تستخدم هذه الشاشات الفيروسات ترميز الصحفيين، مثل لوسيفراس اليراع (لوك) أو البروتينات الفلورية (مثلاً.، التجارة والنقل، دسريد)، التي توفر وسيلة مريحة كمياً تقييم التعبير الجيني الفيروسي كقراءات للنسخ المتماثل الفيروسية9،12. هذه الاستراتيجية يسمح للباحثين تحديد العوامل المضيفة التي أما تعزز أو استعداء النسخ المتماثل الفيروسية كما يتضح من الزيادة أو النقصان، على التوالي، في الفيروسية مراسل إشارات9،12. ومع ذلك، في الغالبية العظمى من الحالات، أجريت هذه الشاشات باستخدام الفيروسات التي يتم تكييفها جيدا لنوع الخلية المضيفة التي كانت تجري دراسة. في حين أن هذه الاستراتيجية يمكن أن تكون هامة لفهم العلاقات كوفولوتيوناري بين مسببات الأمراض الفيروسية ومضيفيهم الطبيعية، أنها تشكل شواغل أساسية بشأن استخدامها في الكشف عن العوامل المضادة للفيروسات المضيف. وفي هذه الحالات، إشارة تحسينا في مراسل الفيروس عند [رني] هو ينظر ضربة قاضية ل، أو المنظمة من عامل الهاتف الخلوي عادة ما يحول دون تكرار الفيروسية. أولاً، إذا كان فيروس بالفعل قادرة على تكرار قوة في الخلية المضيفة يجري بحثها بموجب شروط مراقبة، مجموعة ديناميكية من الشاشة (أي، القدرة على التمييز بين الخلفية وإشارات مراسل الفيروسية المعززة) قد تكون محدودة. ثانيا، هذه المسألة تتفاقم الأوضاع فيها الفيروس تكييف جيدا للخلية المضيفة وفعالة في التصدي لسبل الدفاع المضيف مستهدفون في الشاشة.
نظراً للشواغل المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتفاعل الفيروسات التقليدية-المضيف فحص أساليب، قمنا بتطوير نموذج جديد لدراسة التفاعلات المضيف الفيروسات التي تستغل التهابات المفصليات فاشل بطبيعة الحال في خلايا الحشرات ليبيدوبتيران. هذه الاستراتيجية مستمدة من ملاحظة أن المفصليات البشرية مدروسة، منظمة، يخضع لعدوى فاشلة في الخلايا المشتقة من العثة الغجرية (L. dispar)13. منظمة وبطبيعة الحال المنقولة بواسطة الحشرات ديبتيران (أي، ذباب الرمل) للمضيفين الثدييات، وقد ثبت تجريبيا لتصيب مجموعة واسعة من اللافقاريات وخلية المضيفين الفقاريات على حد سواء في الثقافة و في فيفو14. 11-ك. بايت سلبي بمعنى واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم من منظمة ترميز مرناس سوبجينوميك الخمسة التي تترجم كل إلى البروتينات التي تشكل virion المغلفة. ومع ذلك، أتاحت منظمة عكس النظم الوراثية إنشاء النسخ المتماثل المختصة سلالات ترميز لوك أو البروتينات الفلورية، بالإضافة إلى خمسة الطبيعية منظمة الجينات المنتجات15،،من1617. لأن هذه البروتينات مراسل لا تدمج virion منظمة، أنها توفر قراءات مريحة للتعبير الجيني منظمة التي تحدث بعد الدخول. استخدام سلالات منظمة ترميز بروتينات فلورية خضراء أو لوك، لقد سبق بينا أن التعبير الجيني منظمة قيودا صارمة على دخول الخلايا LD652 وأن التتر منظمة لا تزيد مدة 72 ساعة بعد الإصابة (hpi). وفي المقابل، كوينفيكشن الخلايا LD652 مع بوكسفيروس الثدييات، فيروس اللقاحية (فاكف)، ومنظمة يؤدي إلى زيادات لوغاريتمي في التعبير الجيني منظمة والتتر من هذه النقطة الزمنية. فاكف يخضع التعبير الجيني المبكر وتكرار الحمض النووي، والتعبير الجيني المتأخر في LD652 الخلية الالتهابات، ولكن دورة النسخ المتماثل فاكف فاشلة في نهاية المطاف بسبب virion غير مكتملة morphogenesis18. جينوم الحمض النووي ~ 192 كيلو بايت كبيرة فاكف ترميز البروتينات > 200، كثير منها عرض خصائص إيمونومودولاتوري التي تروج للنسخ المتماثل الفيروسية عن طريق قمع المضيف الاستجابات المناعية19. ولذلك، افترضنا أن المرجح إيمونومودولاتورس فاكف التي تحول دون ردود ديسبار L. عادة تقييد النسخ المتماثل لمنظمة وساطة “الإنقاذ” للنسخ المتماثل لمنظمة في خلايا LD652 التي كوينفيكشن فاكف. ودعما لذلك، تنقذ معاملة الخلايا LD652 مع المانع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي المضيف والاكيتنوميسين د أيضا منظمة النسخ المتماثل في الخلايا LD652، مما يشير إلى أن الاستجابات المضيف النسخ المعتمدة على كتلة منظمة النسخ المتماثل بعد الدخول13.
الملاحظات المذكورة أعلاه تشير إلى أن الطابع التقييدي الطبيعي للخلايا LD652 للإصابة بمنظمة قد توفر خلفية منخفضة نسبيا عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز إشارات مرمزة بمنظمة مراسل (أي، تلك التي تمنع المضيف الدفاعات المضادة للفيروسات). هنا، نحن نقدم الطرق لاستخدام الفلورية أو فحوصات لوك المستندة إلى الشاشة لظروف تخفيف قيود منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد العوامل immunomodulatory فيروسي المرمزة التي كسر قيود منظمة أثناء أما تجارب كوينفيكتيون أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم العوامل الفيروسية المرشح. على سبيل مثال، نحن لتوضيح كيف استخدمنا هذه تقنيات الفحص لتحديد ترميز poxvirus البروتينات A51R كأسرة جديدة من العوامل إيمونومودولاتوري التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الغياب عوامل poxvirus الأخرى13. ثانيا، نحن لتوضيح كيف يمكن استخدام [رني] الفحص في التهابات خلية منظمة LD652 تقييداً لتحديد المضيف التوكسينات العوامل الداخلة في المفصليات تقييد13مباشرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا لقد قمنا بوصف فحوصات بسيطة على الأسفار والتلألؤ الشاشة للظروف التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الثقافات الخلية ليبيدوبتيران التقييدية. العدوى فاشل من منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران يخلق نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة عند المعايرة للتعبير الجيني منظمة. على سبيل المثال، كانت الإشا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الإدارة العامة كانت مدعومة بتمويل من جامعة تكساس جنوب غرب مركز طبي “برنامج الباحثين وهبت”. يشكر المؤلفون مايكل ويت (مركز العلوم الصحية جامعة تينيسي) وشون ويلان (مدرسة هارفارد الطبية) لتوفير منظمة دسريد ومنظمة-لوك. كما يشكر المؤلفون غاري Luker (جامعة ولاية ميشيغان كلية الطب) لهدية نوع من سلالة فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
Referencias
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
