Arbovirus infektioner som Screening verktyg för identifiering av Viral immunmodulerande och värd antivirala faktorer

Förmågan hos virus att produktivt replikeras i en viss värd styrs delvis av tillgången till mottagande cell faktorer som stöder viral intrade och replikering¹. Den virus-spektrum kan också dikteras av kapaciteten av ett virus till counter cellulära antivirala försvar som annars hämma virusreplikation^2,3. Det är resultatet av dessa komplexa virus-värd-interaktioner som slutligen avgör om ett virus kommer att kunna slutföra sin livscykel i en viss värddator. Tanke på de potentiellt patogena konsekvenserna för värden om virusreplikation inträder, är det viktigt att utveckla experimentella strategier för att främja förståelsen av det nycklarna-virus-host samspel som kan rubba balansen mellan misslyckade och produktiv infektioner. Klarlägga molekylära funktioner i virus-host samspel kommer att bidra i utvecklingen av nya och alternativa antivirala terapeutiska strategier.

Med tillkomsten av RNA interferens (RNAi)^4,5 och editering verktyg (t.ex., CRISPR-Cas9, zink finger nukleotider, TALENs)^6,7, det har blivit experimentellt genomförbart att förändra den uttryck av cellulära faktorer på genome-wide skalor och utforska effekterna av dessa förändringar på virusreplikation. Faktiskt, många RNAi och genomet-redigering-baserade skärmar har utförts i ryggradslösa och ryggradsdjur värd celltyper som har avtäcka ny fasetter av virus-host interaktioner^{8,9,10, 11 , 12}. dessa skärmar vanligtvis anställa virus kodning reportrar, såsom firefly luciferas (LUC) eller fluorescerande proteiner (t.ex., GFP, DsRed), som ger bekvämt sätt kvantitativt bedöma viral genuttryck som en avläsning för virusreplikation^9,12. Denna strategi tillåter forskare att identifiera värd faktorer som antingen främja eller motverka dexmedetomidininducerade virusreplikation vilket framgår av ökar eller minskar, respektive, i viral reporter signaler^9,12. Dock i de allra flesta fall, har dessa skärmar utförts med virus som är väl anpassade till den mottagande celltyp där de studeras. Denna strategi kan vara viktiga för att förstå coevolutionary relationer mellan virala patogener och deras naturliga värdar, utgör det grundläggande oro för deras användning i avslöjande värd antivirala faktorer. I dessa fall en förbättring i virus reporter signal vid RNAi knockdown som granskas för eller inaktivering av en cellulär faktor som normalt förhindrar virusreplikation. Först om ett virus är redan kunna kraftfullt replikera i värdcellen undersöks kontroll villkor, kan det dynamiska omfånget på skärmen (dvs, förmågan att skilja mellan bakgrunden och förbättrad viral reporter signaler) begränsas. Det andra förvärras problemet ytterligare av de situationer där viruset är väl anpassade till värdcellen och effektivt motverka värd försvar vägar som är riktade i skärmen.

På grund av de ovanstående funderingar kring traditionella virus-host interaktion screeningmetoder, utvecklade vi ett nytt paradigm för att studera virus-värd-interaktioner som utnyttjar naturligt misslyckade arbovirus infektioner i fjärilsarter insekt celler. Denna strategi härrör från en observation att det väl studerat människors arbovirus, VSV, genomgår en misslyckade infektion i celler från gypsy moth (L. dispar)¹³. VSV är naturligt överförs av sorgmyggor insekter (dvs, sandmyggor) till däggdjur värdar och har visat experimentellt att infektera ett brett utbud av ryggradslösa djur och ryggradsdjur värdar både i cell kultur och i vivo¹⁴. 11-kb negativ-sense enkelsträngat RNA genomet hos VSV kodar fem subgenomic mRNA som översätts varje till de proteiner som utgör den höljeförsedda virion. VSV omvänd genetiska system har dock möjliggjorde skapandet av replikering-behöriga stammar kodning LUC eller fluorescerande proteiner, förutom de fem naturliga VSV gen produkter^15,16,17. Eftersom dessa reporter proteiner inte införlivas i den VSV virion, ger de en bekväm avläsning för VSV genuttryck som uppstår efter posten. Använda VSV stammar kodning GFP eller LUC, har vi tidigare visat att VSV genuttryck är strängt begränsad vid tillträdeet av LD652 celler och att inte öka VSV titrar av 72 timmar efter infektion (hpi). Däremot leder coinfection av LD652 celler med VSV och de däggdjur poxvirus, vacciniavirus (VACV), till logaritmisk ökningar i både VSV genuttryck och titrar av denna tidpunkt. VACV genomgår tidiga genuttryck, DNA-replikation och sena genuttryck i LD652 cell infektioner, men VACV replikering cykeln är slutligen misslyckade på grund av ofullständig virion morfogenes¹⁸. Det stora ~ 192 kb DNA-genomet hos VACV kodar > 200 proteiner, varav många Visa immunmodulerande egenskaper som främjar virusreplikation genom dämpningen av värd immunsvar¹⁹. Därför hypotesen vi som ”räddning” av VSV replikering i LD652 celler av VACV coinfection var troligen medierad av VACV immunomodulatorer som hämmas L. dispar Svaren normalt begränsar VSV replikering. Till stöd för detta räddar behandling av LD652 celler med värd RNA-polymeras II-hämmaren actinomycin D också VSV replikering i LD652 celler, vilket indikerar att transkription-beroende värd Svaren blockera VSV replikering efter posten¹³.

De ovanstående observationerna tyder på att den naturligt restriktiva karaktären av LD652 celler till VSV infektion kan ge en relativt låg bakgrund när screening för de villkor som förbättrar VSV-kodade reporter signaler (dvs, de som hämmar värd antivirala försvar). Här, tillhandahåller vi metoder för att med hjälp av fluorescens eller LUC-baserade analyser till skärmen för villkor som lindra VSV begränsning i fjärilsarter celler. Först, vi visar hur dessa analyser kan användas för att identifiera viralt kodade immunmodulerande faktorer som bryta VSV begränsning under antingen coinfection experiment eller via ektopisk uttryck för kandidat viral faktorer. Som ett exempel illustrera vi hur vi använt dessa screening metoder för att identifiera poxvirus-kodade A51R proteiner som en ny familj av immunmodulerande faktorer som rädda VSV replikering i avsaknad av andra poxvirus faktorer¹³. Det andra illustrera vi hur RNAi screening i restriktiva VSV-LD652 cell infektioner kan användas för att direkt identifiera eukaryota värd faktorer inblandade i arbovirus begränsning¹³.