Här beskriver vi live-cell avbildningstekniker för att kvantitativt mäta om migration och invasionen av glioblastoma hjärnan Tumörstamceller över tid och flera behandling villkor.
Glioblastom (GBM) är en aggressiv hjärntumör som styrs dåligt med de för närvarande tillgängliga behandlingsalternativ. Nyckel dragen av GBMs inkluderar snabb spridning och genomträngande invasion in i normala hjärnan. Återkommande är tänkt att resultera från närvaron av radio – och kemo-resistenta hjärnan Tumörstamceller (BTSCs) att invadera från den ursprungliga cancerogena massan och, således, undgå kirurgisk resektion. Därför kan terapier som riktade BTSCs och invasiva förmåga förbättra den annars dålig prognosen av denna sjukdom. Vår grupp och andra framgångsrikt har fastställts och karakteriserat BTSC kulturer från GBM patientprover. Dessa BTSC kulturer visar grundläggande cancer stamceller egenskaper såsom clonogenic självförnyelse, multi härstamning differentiering och tumör inledande i immun-brist möss. För att förbättra de nuvarande behandlingsmetoder för GBM, krävs en bättre förståelse för mekanismerna bakom BTSC migration och invasion. I GBM är studiet av migration och invasion begränsat, delvis på grund av begränsningarna i befintliga tekniker som inte fullt står för in vitro- tillväxt egenskaper BTSCs odlas som neurospheres. Här beskriver vi snabba och kvantitativa live-cell imaging analyser för att studera både migration och invasion egenskaperna för BTSCs. Den första metoden som beskrivs är BTSC migration analysen som mäter migreringen mot en korrektiv övertoning. Den andra metoden som beskrivs är BTSC invasion analysen vilka bilder och kvantifierar en cellulär invasion från neurospheres in i en matris. De analyser som beskrivs här används för kvantifiering av BTSC migration och invasion över tid och under olika förhållanden.
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och mest aggressiva formen av cancer i hjärnan och, trots den nuvarande terapin som innebär kirurgisk resektion följt av strålning och kemoterapi, median överlevnaden hos patienter är bara 15 månader1. GBM är invasiv, mycket resistenta, och i slutändan en obotlig sjukdom som kräver fortsatt forskning i dess inneboende biologi för att identifiera nya terapeutiska möjligheter. Den höga dödligheten i GBM patienter orsakas primärt av omfattande cellulära invasionen in i angränsande normal hjärnvävnad och migreringen längs blodkärl, vilket leder till ett återfall i sjukdomen efter behandling2,3 . En delmängd av celler, kallas hjärnan Tumörstamceller (BTSCs), som är långsamma cykling och terapeutiskt resistenta, har antagit hypotesen för att leda till sjukdom återfall. GBM BTSCs Visa egenskaper clonogenic självförnyelse, multipotency och tumör-inleder potentiellt4,5,6. BTSCs också behålla sin överordnade GBM tumörer7,8,9,10genetiska, molekylär och fenotypiska heterogenitet. Dessa egenskaper gör BTSCs en extremt användbar modellsystem för att studera GBM och för att utforska nya terapeutiska strategier. In vivo, dessa stamceller-liknande celler klarar av tumörbildning, tillväxt och invasion När inopererad i hjärnan hos neonatala råttor11 och icke-feta diabetiker/svår kombinerad immunbrist (nicka/SCID) möss4. BTSCs förmåga att upprepade gånger bildar invasiva tumörer i vivo att sammanfatta sin ursprungliga tumörer cellulära och histologiska egenskaper starkt stöder deras roll som tumör-inleda celler12.
Nya behandlingsmetoder utvecklas till målet BTSCs och förbättra det långsiktiga resultatet för GBM patienter. För närvarande finns det begränsad förståelse av de cellulära migration och invasion processer som är associerade med terapeutiska motstånd och återfall. Migration och invasion är separata företeelser; migration är en process som underliggande celler riktad rörelse och innebär omorganiseringen av cytoskelettet, adhesionsmolekyler och montering/demontering av fokal kontaktpunkter, medan invasion kräver också fysiska förstörelsen av hinder såsom en extracellulär matrix13. En allmänt accepterad metod för att studera cellmigration och invasion är Boyden kammare assay14,15. För denna teknik, är en dubbel kammare fylld med media, med media i botten kammare kompletteras med en korrektiv. Chemotaxis utlöses med specifika tillväxtfaktorer eller cytokiner, eller fetalt bovint serum som en icke-specifik korrektiv. Efter korrektiv gradient migrera celler genom porösa membran. Vid slutpunkten, kan migrerade cellerna visualiseras och kvantifieras på undersidan av membranet genom färgning med Cytologisk eller fluorescerande färgämnen. Den Boyden migration assay kan ändras till en invasion analys av beläggning den porösa filter med extracellulär matrix komponenter såsom typ I kollagen eller en basalmembranet-liknande matris. Invasiva celler försämras matrisen, gå igenom till botten av filtret porös och kan kvantifieras på ett liknande sätt till migrationen analysen. Andra vanliga migration analyser ingår scratch sår och cell säkerhetszon analyser13. Scratch såret analysen utförs av sprätta en lucka i en cellulär enskiktslager och observera migration av celler från kanten av såret av imaging med jämna mellanrum tills scratch är stängd. I cell utslagning analysen används en fysisk barriär för att skapa en cell-fri zon före odling av celler. Barriären är bort en gång cellerna är konfluenta och migreringen av celler in i cellen-fri zon är avbildade regelbundet16.
Dessa etablerade tidigare analyser används ofta för att studera den migration eller invasion av vidhäftande och homogen cellpopulationer men pose avsevärda nackdelar när man studerar GBM BTSCs eller andra heterogena cancer cellpopulationer. Boyden kammare analysen kan bara generera endpoint mätningar kontra en kinetic bedömning av cellers rörelser. En observation över tid är av hög relevans för mätning av BTSC migration, med tanke på att celler från olika kulturer ofta migrera i olika takt. Som sådan, villkor och tidpunkten för analysen måste optimeras för varje typ av kultur och kräver tidskrävande arbete för adekvat provtagning och kvantifiering. Skrapa och cell uteslutandet analyser inte är väl lämpade att BTSC kulturer som, även när BTSCs är odlade på enskiktslager villkor med laminin-belagda plattor, har vi observerat att BTSCs verkar motstå rörelsen in i det öppna utrymmet och föredrar att bo i nära närhet till andra celler. Dessutom etablerade dessa migration analyser inte tillåter för visualisering och uppföljning av enskilda celler i hela försökstiden. Övervakning av enskilda celler över tid är värdefull för bedömning av migration i heterogena cellpopulationer såsom BTSCs. ytterligare nackdelar med Boyden kammare, scratch, och cell-utslagning zon analyserna för BTSC kulturer är som de kräver relativt hög cell nummer, kan vara tidskrävande att ställa in och antingen snabbt jämvikt eller inte har en korrektiv övertoning. Dessa analyser är som sådan inte idealisk att använda för sällsynta eller långsamt växande cellpopulationer eller för drogkontroll. Dessa analyser är dessutom inte lämpade för att mäta en invasion i en tredimensionell (3D)-format, vilket är särskilt viktigt för BTSCs odlas under neurosphere förhållanden.
Här beskriver vi analyser speciellt modifierats för observation och kvantifiering av migreringen för enskilda BTSCs, och invasionen av GBM BTSCs odlade som neurospheres. Första analysen beskriver en anpassning av Boyden kammare analysen använder live-cell time-lapse imaging och en chemotaxis migration tallrik för att mäta kemotaktisk cell migration13. Live-cell imaging i flera format tillåter för visualisering och kvantifiering av cellmigration flera behandling villkor. Den andra analysen som beskrivs här är en sfäroid invasion assay13,17, vilka åtgärder invasiva egenskaper för BTSCs odlade neurosphere villkor och inbäddade i en 3D extracellulärmatrix under olika behandling villkor. Dessa analyser finns Sammantaget mycket mer kompatibel än tidigare beskrivna metoder för att studera den flyttande och invasiva egenskaper för heterogena BTSC kulturer. De erbjuder också bättre möjligheter för utredning av nya terapeutiska strategier att rikta både migration och invasion, som bidrar väsentligt till återfall i sjukdom och dödlighet.
Med tanke på att cancercellerna breder aktivt, innebär detta en potentiell teknisk utmaning för studien av cellmigration. För migration analysen beskrivs här, BTSCs är pläterade utan tillväxt faktorer som begränsar spridningen och korrektiv toningen av chemotaxisna plattan fullt jämvikta inte över 72 timmar. Dessutom, eftersom cellerna som övervakas med hjälp av live-cell imaging över tid, kan celler visuellt kontrolleras för att säkerställa utbredda celldelning inte sker. För att lyckas med migration analysen är det viktigt att skilja neurospheres helt att enstaka celler och exakt räkna den cell nummer före plätering. Plätering sfärer eller plätering för många celler, vilket resulterar i klumpar, kan förhindra att celler migrerar genom små porer (figur 4A och 4B). Det är också viktigt att undvika att skapa bubblor när plätering cellerna i chemotaxis migration plattan eller att släppa ut membranet skäret på reservoaren botten. Bubblor kan ändra fokus plan och förhindra korrekt kvantifiering (figur 4 c). Hela plattan behöver vara belagd med ett tunt lager av kollagen eftersom detta ger cellerna en yta för att navigera vidare till porerna i plattan, eftersom denna analys kräver celler att uppfylla och sedan migrera över en biologiskt relevanta yta mot korrektiv.
BTSC migration protokollet beskrivs här tillåter för kinetiska bedömning av enskild cellmigration, som kräver färre celler för att testa olika behandling villkor jämfört med befintliga protokoll. Detta är viktigt för kulturer som växer mycket långsamt, eftersom det kan vara svårt att samla ett stort antal celler för experiment. Låg pore tätheten av chemotaxisna migration plattan möjliggör en långsammare Jämviktstiden korrektiv övertoningens, större än 72 h, och mer effektivt härmar den biologiska processen kemotaktisk migration över en längre tidsperiod. Protokollet var optimerad för att ha ett mycket tunt lager av kollagen beläggning på chemotaxis migration plattan att säkerställa att analysen åtgärder migration och inte invasionen. Det underlättar också imaging och kvantifiering av enstaka celler som de iakttar den kollagenmatrisen beläggning membran skäret. En begränsning av tekniken är dock att kvantifiering av migrering över flera brunnar över tid är kraftigt förenklat och påskyndat använder kommersiell programvara (se Tabell för material). En anmärkningsvärd fördel migration analysens är som beskrivs här bred anpassningsförmåga av protokollet till andra celltyper. Det kommer att vara särskilt användbart för att kvantifiera kemotaktisk migration av cellinjer som är antingen långsamt växande, svårt att följa, eller migrera långsamt.
För att säkerställa framgången för BTSC invasion analysen, är det nödvändigt att samla in neurospheres innan de blir större än 200 µm. större kulorna har ett plan i fokus som är för stor för att konsekvent bild och kvantifiera (figur 5 c). Dessutom kan neurospheres börja klumpa och aggregera med andra neurospheres. Detta påverkar förvärvet av korrekta och konsekventa data. Det är dessutom viktigt att neurospheres får bosätta sig på botten av brunnen medan kollagen är fortfarande på is, att neurospheres till avbildas i ett enda plan av fokus (figur 5 d). Likaså är det viktigt att låta kollagen ställa helt utan rörliga plattan eftersom detta kan orsaka bildandet av en jämn matris, som negativt kan påverka bildkvaliteten (figur 5 d). För BTSC invasion analysen beskrivs här, är en av de stora fördelarna att BTSCs odlade som neurospheres kan bedömas för invasion direkt, utan att behöva odlas adherently. Dessutom kan BTSC neurospheres bäddas in i någon extracellulära matrix, antingen med hjälp av enskilda komponenter i den extracellulära matrixen från en specifik vävnad eller en kommersiellt tillgänglig basalmembranet blandning. Ange den extracellular matrisen kan hjälpa till att identifiera eller testa specifika mekanismer av invasion. Exempelvis med detta protokoll är det möjligt att bedöma effekten av inriktning enskilda medlemmar av matrix metallopeptidase familj av gener, som är kända för att försämra specifika matrix komponenter. Alternativt, även om detta protokoll gäller BTSC neurospheres, celler odlas som sfärer kan användas på ett liknande sätt. Exempel är bröstcancerceller odlade som mammospheres eller Primär kolorektal cancerceller odlade som tumorspheres; Detta begränsar dock tekniken till celltyper som kan växa som sfärer i en kultur. Andra fördelar med både migration och invasion analyser är att de är lätta att ställa in, de arbetar i en 96-väl format, och data är kvantifierbara över tid.
Sammantaget för att förhindra efterbehandling GBM upprepning, är det nödvändigt att utveckla metoder att underlättar utredningen av BTSC migration och invasion. Det migration-protokollet som beskrivs här erbjuder många fördelar jämfört med tidigare etablerade migration analyser, särskilt för studiet av GBM BTSCs. Detta förbättrade migration protokoll innebär att separera BTSCs odlade neurosphere villkor och plätering enstaka celler i en 96-väl kollagen-belagd chemotaxis migration tallrik. Live-cell imaging system med kan migrering av BTSCs övervakas och kvantifieras med tiden. Invasion analysen beskrivs här möjliggör övervakning av BTSC invasioner från neurospheres in i en matris. Denna analys innebär att bädda in neurospheres i en kollagenmatrisen, eller en annan proteinrika extracellulär matrix, i en plattan med 96 brunnar. Avbildning av plattan med en live-cell time-lapse imaging system möjliggör analys av BTSC invasioner behandlas olika villkor över tid. Dessa analyser, ger därför ett värdefullt verktyg att forskare hoppas att bättre förstå mekanismerna bakom BTSC migration och invasion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Rozina Hassam och Orsolya Cseh för deras tekniska support. Detta forskningsprojekt stöddes delvis genom bidrag från stiftelsen Kanada för Innovation (till H. Liselott Luchman och Samuel Weiss) och Kanadas Stem Cell Networks (också till H. Liselott Luchman och Samuel Weiss).
Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |