活体细胞成像技术研究胶质瘤脑干细胞的迁移和侵袭

1. 从人脑胶质瘤标本中培养脑肿瘤干细胞 注: BTSC 文化是以前建立的人肾小球病患者样本6,7,8,9,10。 在装有70% 乙醇的烧杯中解冻一小瓶低温保存的 BTSCs, 放在37摄氏度的水浴中, 直到最后的冰解冻。在15毫升圆锥管中稀释10毫升介质中的解冻细胞, 将150相对离心力 (区域合作框架) 的细胞离心为7分钟。注意: 在这些协议中, 完整的媒体是指用于区域性 BTSCs 的标准媒体 (以前是凯利等)。6, 典型地以成长因素存在。无生长因子的介质指的是所有组件的基本介质, 但没有任何生长因子补充。 吸入介质, 并用重悬8毫升完整介质中的细胞, 将细胞和介质转移到 T25 瓶中。 在不附着条件下进行1周的培养后, 每天监测烧瓶, 并根据需要补充 1-2 毫升的内容, 如果媒体开始耗尽或开始变得酸性, 如橙色黄色变化所示。通道细胞当 neurospheres 到达大约250微米的直径, 通常在 10-14 d 之间 (图 1)。注: 不同 BTSC 文化的加倍时间差异很大。干细胞尺寸可以用眼千分尺测量。 通过 BTSCs, 收集介质和 neurospheres, 吹打介质放在烧瓶的表面上, 收集所有 neurospheres 并将其转移到15毫升锥形管上, 在150区域合作框架内离心管7分钟。注: 可在显微镜下检查烧瓶, 以确保所有 neurospheres 都已收集。可以执行额外的5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或媒体的清洗, 以收集任何必要的剩余 neurospheres。 将 BTSC neurospheres 分离成单个细胞, 吸出培养基, 加入1毫升预热细胞脱离溶液, 孵育37摄氏度7分钟 Triturate BTSC 悬浮 40x, P1,000 微设于 800 ul。注意: 如果 neurospheres 不离解, 细胞可以在37摄氏度的时间内孵化。 添加5毫升的 PBS (用抗生素青霉素和链霉素) 到离解 BTSCs 和离心机的细胞在150区域合作框架7分钟。 根据细胞颗粒的大小, 在 1-4 毫升的完整介质中吸出上清和并用重悬 BTSCs。注: 如果浓度超出精确的细胞计数的准确检测限度, 细胞悬浮液需要进一步稀释。 使用不包括死细胞的染料, 如台盼蓝, 计数的存活细胞数量和种子的 BTSCs 到瓶子或盘子的兴趣, 通常, 20万-30万细胞8毫升的完整的媒体在一个 T25 瓶。 2. 脑肿瘤干细胞迁移试验 种子20万细胞在一个 T25 烧瓶8毫升的完整培养基 1-2 周前计划进行迁移试验。注意: 电镀和执行化验之间的时间取决于所使用的 BTSC 文化的生长速率。 为了测试药物治疗对移徙的影响, 预处理适当的车辆, 如亚砜和感兴趣的药物, 将车辆或药物储存的适用体积直接添加到含有细胞的介质的不同井中。 用一层薄薄的胶原蛋白将其涂上, 制备趋化迁移板 (图 2A)。 计算96井趋化板的井数, 需要涂上胶原蛋白。每个条件至少包括三个复制井。 稀释5毫克/毫升的 i 型胶原蛋白到0.2 毫克/毫升在纯醋酸稀释到0.14% 在养殖级水。 将0.2 毫克/毫升的胶原蛋白移到膜插入井和正在使用的底油层井中。注: 底板的底部储层需要225µL, 膜插入井需要75µL 的胶原蛋白来进行适当的涂层。 将迁移板放置在37摄氏度的孵化器中, 1 小时. 从水井中吸取胶原溶液, 而不划伤胶原涂层。 用无菌 1x PBS 洗涤水井2x。如果盘子没有立刻被使用, 吸入 PBS 并且存放它在4°c 2 星期。使用前, 将趋化迁移板加热至室温。 制备趋化迁移板块的底储层。 吸管225µL 的培养基 (没有生长因子), 补充10% 的血清作为趋化物, 到底部水库井的趋化迁移板块。 轻轻地将膜插入到底部的储层中, 以避免产生气泡。 将细胞板入趋化移印板的膜插入。 并用重悬游离 BTSCs 在培养基中 (无生长因子), 细胞密度为5万细胞/毫升。在不同药物治疗过程中评估迁移时, 向媒体添加药物。交替, 种子相同数量的预处理细胞和控制细胞, 同时保持最终药物浓度时, 电镀。 板50µL 的 BTSCs 从步2.4.1 入每个井迁移板材在期望的治疗情况下。 图像的趋化迁移。 将趋化迁移板置于活细胞成像系统中, 并设置自动成像软件, 每 1-2 小时即可获取该板的显微图像, 最多72小时. 使用商用软件 (见材料表), 右键单击时间线, 并将扫描间隔设置为每2小时24小时。注意: 所用的 BTSC 文化之间的时间间隔和总使用时间会有所不同;开始与2小时间隔为72小时, 直到经验得到了与个体 BTSC 文化。如果自动成像系统不可用, 则可以用显微镜和连接到成像软件的照相机手动获取相同视野的图像。 一旦图像采集完成, 获取整个实验的图像, 并创建一个处理定义使用分析软件, 区分细胞从背景的细胞膜和迁移毛孔 (图 2B, 红色面具).使用商业软件 (参见材料表), 选择新的处理定义并将 BTSCs 的处理定义设置设置为种子阈值52,增长阈值为 85,调整大小(像素) 1,最小面积为200微米2。将此处理定义应用于膜的底部。如果不准确区分来自背景膜的细胞, 则修改此分析。 收集数据作为细胞膜底部的细胞表面积, 用于三个复制井, 这只计算通过毛孔迁移的细胞。图2中单元格的迁移 (迁移的单元格区域) 随着时间推移 (图 2C,图 3)。注: 确保在第一时间点的膜的顶面上镀和计数的细胞相对数量在所有处理条件之间类似 (小于20% 的变化), 以避免不均匀电镀的任何影响。使用商业软件 (参见材料表) 的数据收集可以通过启动在步骤2.5.2 中创建的处理定义来执行, 单击度量值, 然后在图形/导出上, 然后再进行数据导出。. 3. 脑肿瘤干细胞干细胞侵袭试验 种子20万细胞在8毫升的完整培养基在一个 T25 瓶 1-2 周前计划进行入侵检测。注意: 从电镀到执行化验的时间取决于所使用的 BTSC 文化的增殖率。 对于预处理过的细胞, 在 neurospheres 准备好进行入侵之前, 在预定的时间路线上, 将感兴趣的化合物添加到所需浓度的烧瓶中。 等待, 直到平均干细胞大小约 150-200 微米;通常, 这需要 7-14 d, 这取决于所使用的 BTSC 区域性。注: 观察瓶内球形尺寸分布是典型的。 提示和轻轻地混合烧瓶与吸管和移动 500 ul 的 BTSC neurospheres 到1.5 毫升圆锥管为每个治疗条件;这将用于板三复制井。注意: 步骤 3.3.1-3.3.2 是可选的, 但建议第一次入侵实验的新 BTSC 文化。 要确定最终在井中的 neurospheres 的密度, 请在步骤3.3 中准备一个1.5 毫升管。轻轻地混合 neurospheres 和移动 100 ul 进入一个单独的96井板块, 并允许 neurospheres 以重力解决5分钟。 检查显微镜下的 neurospheres 数, 以确保多个 neurospheres 在该井的区域, 将被成像而不会过度拥挤。注意: 入侵 neurospheres 需要足够的空间, 以三重直径, 而不与相邻的 neurospheres 互动。每个井的 neurospheres 数可以通过计算每个井的 neurospheres 数来调整, 并在步骤3.3 中加入更多或更少的 neurospheres 从 T25 烧瓶到1.5 毫升圆锥管。 将1.5 毫升锥形管与步骤3.3 中的单元格放在冰上, 并在冰上执行步骤 3.5-3.7。 让 neurospheres 在1.5 毫升锥形管的底部, prechill 5 分钟, 并在冰上标上96井板。 并用重悬细胞外基质蛋白中的 neurospheres。 准备 500 ul 的0.4 毫克/毫升 i 型胶原蛋白溶液在冰上为每个治疗条件: 添加 459 ul 的培养基 (无生长因子), 40 ul 的5毫克/毫升胶原蛋白溶液, 0.92 ul 的无菌1N 氢氧化钠 (表 1)。注: 500 ul 的胶原蛋白溶液是每个治疗条件要求: 100 ul 为每三个复制井和 200 ul 的过剩。药物治疗需要添加到预期的最终浓度, 从解决方案的媒体部分减去。本协议描述了 i 型胶原蛋白作为细胞外基质蛋白的应用;然而, 任何细胞外基质蛋白都可以测试。此外, 对于具有较慢的入侵率的 BTSC 文化, 可以在媒体中补充生长因子或血清, 以提高入侵率。 从步骤3.5 中的 neurospheres 解决后, 尽可能多地吸入介质, 而不会失去在底部沉淀下来的干细胞颗粒。轻轻并用重悬 neurospheres 在 500 ul 的胶原溶液中制备的步骤3.6.1。 添加 100 ul 的胶原和干细胞混合物, 三复制井的96井板在冰上。允许 neurospheres 在冰上安定5分钟。 将96井板转移到37摄氏度孵化器中, 5 分钟, 以便胶原聚合。 立即准备图像的96井板。 将96井板放入活细胞成像系统的托盘或显微镜的舞台上, 以获取图像作为参考, 在电镀时的干细胞尺寸, 在入侵开始之前。 每小时获取图像, 直至入侵率停滞不前;通常, 这在24小时内发生。注: 成像间隔可以根据所使用的设备进行修改。对于具有不同入侵率的 BTSC 区域性, 也可以修改成像间隔和总运行时间。 确定 BTSCs 随着时间推移侵入矩阵时的表面积增加。注: 在电镀时的表面面积, 计算为平均三复制井, 需要类似 (小于20% 的变化, 横跨所有井) 之间的不同处理条件, 以确保在 BTSC 入侵的差异不受镀 neurospheres 的数量或大小的强烈影响。 对于活细胞分析系统, 使用10X 目标进行图像采集, 并为三个复制井获取四幅图像。为了确定相对的细胞表面积, 表示为井的百分比汇流, 建立一个处理定义, 具体地强调在井的背景下的细胞。使用商用软件 (见材料表), 选择一个新的处理定义, 并将分割调整设置为 0.8, 区域最小为300微米2, 偏心最大值为0.99。如果不准确区分单元格与背景, 则修改此分析。注: 如果使用其他方法对干细胞入侵进行图像处理, 建议在一段时间内为三个复制井获取多个视图字段。但是, 在每个时间间隔内不成像完全相同的视场将增加所收集数据的标准误差。计算机软件可以用来帮助测量每个图像中入侵细胞的表面积。 在每个时间点收集数据作为每个井的总细胞表面积 (相对或绝对), 并确定三复制井的平均值。通过在一段时间内绘制增加的细胞面积来图 BTSCs 的侵袭。注意: 使用商业软件进行数据收集 (参见材料表) 可以通过启动在步骤3.10.1 中创建的处理定义, 单击度量, 然后在图形/导出, 然后再在数据导出中执行。.