Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.
Glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral agressivo que é mal controlado com as opções de tratamento disponíveis atualmente. Principais características do GBMs incluem rápida proliferação e invasão generalizada no cérebro normal. Recorrência é pensada para resultar da presença do rádio e quimio resistentes ao cérebro tumor células-tronco (BTSCs) que invadem longe da massa cancerosa inicial e, assim, evitar a ressecção cirúrgica. Daí, terapias que se destinam a BTSCs e suas habilidades invasivas podem melhorar o contrário de mau prognóstico desta doença. O nosso grupo e outros com sucesso estabelecido e caracteriza culturas BTSC de amostras de pacientes GBM. Essas culturas BTSC demonstram Propriedades de células-tronco de câncer fundamentais como diferenciação de auto-renovação, linhagem multi clonogenic e iniciação de tumor em camundongos deficientes em imune. A fim de melhorar as abordagens terapêuticas atuais para GBM, é necessária uma melhor compreensão dos mecanismos de migração BTSC e invasão. Em GBM, o estudo da migração e invasão é restrito, em parte, devido às limitações das técnicas existentes que não plenamente em conta as características de crescimento em vitro de BTSCs crescidos como neurospheres. Aqui, descrevemos rápidos e quantitativos viver-pilha de imagem ensaios para estudar a migração e a invasão de propriedades de BTSCs. O primeiro método descrito é o ensaio de migração BTSC que mede a migração em direção a um gradiente de quimiotático. O segundo método descrito é o ensaio de invasão de BTSC que as imagens e quantifica uma invasão celular da neurospheres em uma matriz. Os ensaios aqui descritos são utilizados para a quantificação da migração BTSC e invasão ao longo do tempo e sob condições de tratamento diferentes.
Glioblastoma (GBM) é a forma mais comum e agressiva de câncer de cérebro e, apesar da atual terapia envolver ressecção cirúrgica seguida de radiação e quimioterapia, a sobrevida média dos pacientes é um mero 15 meses1. GBM é invasivo, altamente resistentes aos medicamentos, e, finalmente, uma doença incurável que requer continuou a pesquisa em sua biologia inerente a fim de identificar novas avenidas terapêuticas. A elevada mortalidade dos pacientes GBM é causada principalmente pela extensa invasão celular no tecido cerebral normal adjacente e a migração ao longo dos vasos sanguíneos, o que leva a uma recorrência da doença após tratamento2,3 . Um subconjunto de células, denominado cérebro tumor células-tronco (BTSCs), que são lentas, ciclismo e terapeuticamente resistente, têm sido a hipótese de levar à recorrência da doença. GBM BTSCs exibir as propriedades de auto-renovação de clonogenic, multipotency e tumor-iniciando potenciais4,5,6. BTSCs, também, manter a heterogeneidade genética, fenotípica e molecular de seu pai GBM tumores7,8,9,10. Estas propriedades tornam o BTSCs um sistema de modelo extremamente útil para o estudo da GBM e para explorar novas estratégias terapêuticas. In vivo, estas células estaminais são capazes de invasão quando implantado no cérebro de ratos neonatal11 , crescimento e formação de tumor e não-obesos diabéticos/severa combinada de ratos de imunodeficiência (NOD/SCID)4. A capacidade de BTSCs repetidamente formar tumores invasivos na vivo que recapitular as características celulares e histológicas dos tumores originais fortemente suporta seu papel como células de tumor-iniciando12.
Novas abordagens terapêuticas estão sendo desenvolvidas para o alvo BTSCs e ajudam a melhorar o resultado a longo prazo para pacientes com GBM. Atualmente, há limitada compreensão dos processos de migração e invasão celulares que estão associados à resistência terapêutica e recorrência. Migração e invasão são fenômenos distintos; migração é o processo subjacente o movimento direcionado de células e envolve a reorganização do citoesqueleto, moléculas de adesão e montagem/desmontagem focais de pontos de contacto, Considerando que a invasão também requer a destruição física das barreiras como uma matriz extracelular13. Uma metodologia amplamente aceita de estudar a invasão e a migração celular é o ensaio de Boyden câmara14,15. Para esta técnica, uma câmara de dupla é preenchida com mídia, com os meios de comunicação na câmara inferior, complementada com um quimiotático. Quimiotaxia é acionada usando fatores de crescimento específicos ou citocinas ou soro fetal bovino como um específico quimiotático. Seguindo o gradiente do quimiotático, células migram através da membrana porosa. No ponto de extremidade, as células migradas podem ser visualizadas e quantificadas na parte inferior da membrana pela coloração com corantes citológicos ou fluorescentes. O ensaio de migração pode ser modificado para um ensaio de invasão revestindo o poroso Boyden filtrar com componentes da matriz extracelular, como tipo eu colagénio ou uma matriz de membrana basal, como. Células invasoras degradam a matriz, percorrer a parte inferior do filtro poroso e podem ser quantificadas de maneira semelhante para o ensaio de migração. Outros ensaios de migração comumente usados incluem o risco de ferimento e zona de exclusão de célula ensaios13. O ensaio de risco de ferimento é executado pelo coçar uma lacuna em uma monocamada celular e observando a migração das células da borda da ferida por imagens em intervalos regulares até que o zero é fechado. No ensaio de exclusão de célula, uma barreira física é usada para criar uma zona livre de célula antes da semeadura de células. A barreira é removido uma vez que as células são confluentes e a migração das células para a zona livre de célula é fotografada regularmente16.
Estas previamente estabeleceram ensaios são frequentemente usados para estudar a migração ou invasão da populações de células aderentes e homogénea, mas pose de desvantagens consideráveis quando estudando GBM BTSCs ou outras populações de células de câncer heterogêneos. O ensaio de Boyden câmara pode gerar apenas de ponto de extremidade medidas contra uma avaliação cinética do movimento da célula. Uma observação ao longo do tempo é de alta relevância para a medição de migração BTSC, dado que as células de diferentes culturas muitas vezes migram em taxas diferentes. Como tal, as condições e o tempo do ensaio deve ser otimizada para cada tipo de cultura e requer mão de obra demorada de amostragem adequada e de quantificação. A exclusão de zero e a célula ensaios não são well-suited para culturas BTSC como, mesmo quando BTSCs são cultivadas sob condições de monocamada em placas com revestimento em laminina, temos observado que BTSCs parecem resistir o movimento para o espaço aberto e preferem ficar em fechar proximidade a outras células. Além disso, estes estabeleceram ensaios de migração não permitem a visualização e monitoramento de células individuais ao longo de um experimento. O monitoramento de células individuais ao longo do tempo é valioso para a avaliação de migração de populações de células heterogêneas, tais como BTSCs. desvantagens adicionais dos Boyden câmara, zero e a célula-exclusão zona ensaios para culturas BTSC que são eles exigem relativamente alta de celulares, pode ser demorado para configurar, e também equilibrar rapidamente ou não têm um gradiente quimiotático. Como tal, estes ensaios não são ideais para usar para populações de células raras ou crescimento lento ou de despistagem de drogas. Além disso, estes ensaios não são adequados para medir uma invasão em formato tridimensional (3D), que é especialmente importante para BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere.
Aqui, descrevemos os ensaios especificamente modificados para observação e quantificação da migração para BTSCs individuais e para a invasão da GBM BTSCs cultivadas como neurospheres. O primeiro ensaio descreve uma adaptação do ensaio câmara Boyden usando a imagem latente de lapso de tempo de viver-pilha e um prato de migração de quimiotaxia para medir célula Quimiotáticos migração13. Imagem latente da viver-pilha em um formato bem multi permite a visualização e quantificação da migração celular sob várias condições de tratamento. O segundo ensaio descrito aqui é um esferoide invasão ensaio13,17, que mede as propriedades invasivas de BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere e incorporado em uma matriz extracelular 3D sob vários tratamentos condições. Em geral, estes ensaios são muito mais compatíveis do que metodologias descritas anteriormente para estudar as propriedades migratórias e invasoras de culturas BTSC heterogêneas. Eles também oferecem melhores oportunidades para a investigação de novas estratégias terapêuticas para o alvo, migração e invasão, que contribuem significativamente para a recorrência da doença e letalidade.
Dado que as células cancerosas proliferam ativamente, isto coloca um potencial desafio técnico para o estudo da migração celular. Para o ensaio de migração descrito aqui, BTSCs são banhados sem fatores de crescimento, que limita a proliferação e o gradiente quimiotático da placa quimiotaxia não equilibrar totalmente mais de 72 horas. Além disso, como as células estão sendo monitoradas usando a imagem latente da viver-pilha ao longo do tempo, as células podem ser monitoradas visualmente para garantir a divisão celular generalizada não está ocorrendo. Para o sucesso do ensaio de migração, é importante dissociar o neurospheres completamente para células únicas e contar com precisão o número de células antes de chapeamento. Chapeamento de esferas ou metalização de muitas células, o que resulta na aglutinação, pode impedir que as células migrando através dos pequenos poros (Figura 4A e 4B). Também é importante evitar a criação de bolhas quando chapear as pilhas na placa de migração de quimiotaxia ou apoiando a inserção da membrana sobre o reservatório inferior. Bolhas podem alterar o plano de foco e evitar a quantificação exata (Figura 4). O prato inteiro precisa ser revestido com uma fina camada de colágeno, porque isso dá células uma superfície para navegar para os poros na placa, como este ensaio requer células de aderir a e em seguida migram através de uma superfície biologicamente relevante para o quimiotático.
O protocolo de migração BTSC aqui descrito permite a avaliação cinética da migração de células individuais, que requerem menos células para testar as condições de tratamento diferente quando comparado aos protocolos existentes. Isto é importante para culturas que crescem muito lentamente, como pode ser difícil coletar um grande número de células para a experimentação. A densidade de poros de baixo da placa de migração quimiotaxia permite um equilíbrio mais lento do gradiente quimiotático, superior a 72 h e mais efetivamente, imita o processo biológico de migração quimiotáctica durante um longo período de tempo. O protocolo foi otimizado para ter uma camada muito fina de revestimento de colágeno na placa quimiotaxia de migração para garantir que a migração de medidas de ensaio e não invasão. Também facilita a imagem e a quantificação de células únicas como aderem à matriz de colagénio revestimento inserção da membrana. No entanto, uma limitação da técnica é que a quantificação da migração através de vários poços ao longo do tempo é extremamente simplificada e acelerada usando software comercial (ver Tabela de materiais). Uma vantagem notável do ensaio de migração conforme descrito aqui é a ampla capacidade de adaptação do protocolo para outros tipos de células. Será especialmente útil para quantificar a migração quimiotático de linha celular que são de qualquer crescimento lento, difícil de aderir ou migrar lentamente.
Para garantir o sucesso do ensaio invasão BTSC, é necessário recolher neurospheres antes que se tornem maiores do que 200 µm. pontuações maiores esferas têm um plano de foco que é demasiado grande para consistentemente imagem e quantificar (Figura 5). Além disso, neurospheres pode começar a amontoar e agregar com outros neurospheres. Isso afeta a aquisição de dados precisos e consistentes. Além disso, é essencial que as neurospheres são permitidos para resolver sobre o fundo do poço, enquanto o colágeno é ainda no gelo, para permitir que o neurospheres ser fotografada em um único plano de foco (Figura 5). Da mesma forma, é importante permitir que o colágeno definir totalmente sem mover a placa, pois isso pode interromper a formação de uma matriz do mesmo, que pode afetar negativamente a qualidade da imagem (Figura 5). Para o ensaio de invasão BTSC descrito aqui, uma das principais vantagens é que BTSCs cultivadas como neurospheres podem ser avaliadas para invasão diretamente, sem a necessidade de ser cultivado aderentemente. Além disso, BTSC neurospheres pode ser incorporado em qualquer matriz extracelular, ou usando os componentes individuais da matriz extracelular de um tecido específico, ou usando uma mistura comercialmente disponível da membrana basal. Especificando a matriz extracelular pode ajudar a identificar ou testar mecanismos específicos de invasão. Por exemplo, com este protocolo, é possível avaliar o efeito de direcionamento membros individuais da família metallopeptidase de genes, que são sabidos para degradar componentes específicos matriz matriz. Como alternativa, embora este protocolo é específico para BTSC neurospheres, quaisquer células cultivadas como esferas podem ser usadas em uma forma similar. Exemplos incluem células de câncer de mama cultivadas como mammospheres ou câncer colorretal primário de células cultivadas como tumorspheres; no entanto, isso limita a técnica para tipos de célula que pode crescer, como esferas em uma cultura. Outras vantagens dos ensaios tanto a migração e invasão são que eles são fáceis de configurar, eles trabalham em um formato de 96 poços, e os dados são quantificáveis ao longo do tempo.
Em geral, a fim de prevenir a recorrência de GBM pós-tratamento, é essencial desenvolver metodologias que facilitam a investigação de BTSC migração e invasão. O protocolo de migração descrito aqui oferece muitas vantagens sobre os ensaios de migração previamente estabelecidos, especialmente para o estudo da GBM BTSCs. Este protocolo melhorado migração envolve dissociando BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere e chapeamento de células individuais em um prato de migração quimiotaxia de colágeno-revestido de 96 poços. Usando um sistema de imageamento de viver-pilha, a migração de BTSCs pode ser monitorizada e quantificada ao longo do tempo. O ensaio de invasão aqui descrito permite o monitoramento de invasões BTSC de neurospheres em uma matriz. Este ensaio envolve a incorporação de neurospheres em uma matriz de colagénio, ou outro rico em proteínas da matriz extracelular, em uma placa de 96 poços. Imagem latente da placa com um sistema de imageamento de lapso de tempo de viver-pilha permite a análise de invasões de BTSC sob condições de tratamento diferentes ao longo do tempo. Estes ensaios, portanto, fornecem uma ferramenta valiosa para cientistas na esperança de compreender melhor os mecanismos subjacentes BTSC migração e invasão.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecer Rozina Hassam e Orsolya Cseh pelo apoio técnico. Este projecto de investigação foi apoiado em parte por subsídios da Fundação de Canadá para a inovação (para H. Artee Luchman e Samuel Weiss) e a redes de células-tronco do Canadá (também para H. Artee Luchman e Samuel Weiss).
Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |