Her beskriver vi live-celle Bildeteknikker å kvantitativt mål for overføring og invasjonen av glioblastom hjerne svulst stamceller over tid og flere behandling vilkår.
Glioblastom (GBM) er en aggressiv hjernesvulst som er dårlig kontrollert med de tilgjengelige behandlingstilbud. Nøkkel vise egenskaper av GBMs inkluderer raske spredningen og gjennomgripende invasjonen i normal hjernen. Regelmessighet er antatt å skyldes tilstedeværelse av radio – og kjemoterapi-resistant hjerne svulst stamceller (BTSCs) som invadere fra første kreft massen, og dermed unngå kirurgisk resection. Derfor kan behandling som BTSCs og deres invasiv evner forbedre ellers dårlig prognose av denne sykdommen. Vår gruppe og andre har etablert og preget BTSC kulturer fra GBM pasientprøvene. Disse BTSC kulturer demonstrere grunnleggende kreft stamcelleforskningen egenskaper som clonogenic selvtillit fornyelse, flere avstamning differensiering og svulst innvielse i immun mangelfull mus. For å forbedre de gjeldende terapeutiske metoder for GBM, er en bedre forståelse av mekanismer for BTSC overføring og invasjonen nødvendig. I GBM er studiet av migrasjon og invasjonen begrenset, delvis på grunn av begrensningene av eksisterende teknikker som ikke fullt ut forklares vekst i vitro egenskapene til BTSCs vokst som neurospheres. Her beskriver vi rask og kvantitativ live-celle tenkelig analyser for å studere både overføring og invasjonen egenskapene for BTSCs. Den første metoden beskrevet er BTSC overføring analysen som måler overføringen mot chemoattractant gradering. Den andre metoden beskrevet er BTSC invasjon analysen der bildene og kvantifiserer en mobilnettet invasjon fra neurospheres i en matrise. Analyser beskrives her brukes for kvantifisering av BTSC overføring og invasjonen over tid og vilkår forskjellig behandling.
Glioblastom (GBM) er den vanligste og aggressiv kreft i hjernen og til tross for den gjeldende terapien som involverer kirurgisk resection etterfulgt av stråling og kjemoterapi, median overlevelse av pasientene er bare 15 måneder1. GBM er invasiv, svært resistente, og til slutt en uhelbredelig sykdom som krever fortsatte forskningen i sin iboende biologi for å identifisere romanen terapeutiske veier. Den høye dødeligheten av GBM pasienter er hovedsakelig forårsaket av omfattende mobilnettet invasjonen i tilstøtende normal hjernevevet og overføringen langs blodkar, noe som fører til en gjentakelse av sykdommen etter behandling2,3 . En gruppe celler, kalles hjerne svulst stilk celler (BTSCs), som er trege sykling og terapeutisk motstandsdyktig, har vært antatt føre til sykdom regelmessighet. GBM BTSCs vise egenskaper clonogenic selvtillit fornyelse, multipotency og svulst-starte potensielle4,5,6. BTSCs også beholde den genetiske molekylære og fenotypiske heterogenitet deres overordnede GBM svulster7,8,9,10. Disse egenskapene gjør BTSCs en svært nyttig modellsystem for studier av GBM og for å utforske romanen strategier. I vivo, disse stammen som cellene er i stand til tumor formasjon, vekst og invasjonen når implantert i hjernen av neonatal rotter11 ikke-obese diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NIKKER/SCID) mus4. Evnen til å BTSCs til gjentatte ganger invasjonen svulst i vivo recapitulate mobilnettet og histologiske kjennetegner deres opprinnelige tumorer sterkt støtter sin rolle som svulst-starte celler12.
Romanen terapeutiske metoder blir utviklet til målet BTSCs og forbedre om langsiktig utkom for GBM pasienter. Det er foreløpig begrenset forståelse av mobilnettet migrasjon og invasjonen prosessene som er tilknyttet terapeutiske motstand og regelmessighet. Migrasjon og invasjonen er tydelig fenomen; migrasjon er prosessen underliggende regissert bevegelsen av celler og innebærer omorganiseringen av cytoskjelett, vedheft molekyler og montering/demontering av fokal kontaktpunkter, mens invasjonen krever også fysisk ødeleggelse av barrierer som en ekstracellulær matrix13. En allment akseptert metode av celle migrasjon og invasjonen er den Boyden Chamber analysen14,15. For denne teknikken fylt en dobbel kammer med medier, med media i bunnen kammeret supplert med en chemoattractant. Chemotaxis utløses bruker bestemte vekstfaktorer eller cytokiner eller fosterets bovin serum som en uspesifisert chemoattractant. Etter gradient av chemoattractant overføre celler gjennom porøs membran. På sluttpunktet, kan migrerte cellene visualisere og kvantifisert på undersiden av membran av flekker med fargemaskin eller fluorescerende fargestoffer. Boyden overføring analysen kan endres til en invasjon analysen av belegg den porøse filtrere med ekstracellulær matrix komponenter som type jeg kollagen eller en kjeller membran som matrise. Invasiv celler fornedre matrix, bla gjennom nederst i porøse filteret og kan kvantifiseres på en lignende måte til overføring analysen. Andre brukte migrasjon analyser inkluderer scratch sår og celle sonen søk13. Scratch såret analysen utføres av skrape et hull i en mobilnettet monolayer og observere migrering av celler fra kanten av såret av tenkelig regelmessig til scratch lukkes. I celle utelukkelse analysen, en fysisk barriere til å opprette en celle-fri sone før Såing av celler. Barrieren er fjernet når cellene er confluent og migrering av cellene i celle-fri sone er fotografert regelmessig16.
Disse etablerte analyser brukes ofte for å studere migrering eller invasjon av tilhenger og homogen celle populasjoner, men utgjør betydelig ulemper ved å studere GBM BTSCs eller andre heterogene kreft celle populasjoner. Boyden kammeret analysen kan bare generere endepunktet mål mot en kinetisk vurdering av cellen bevegelse. En observasjon over tid er høy relevans for måling av BTSC migrasjon, gitt at celler fra ulike kulturer ofte migrere til ulike priser. Som sådan, betingelsene og tidspunktet for analysen må være optimalisert for hver kultur og krever tidkrevende arbeid for tilstrekkelig prøvetaking og kvantifisering. Bunnen og celle utelukkelse analyser ikke er velegnet til BTSC kulturer som, selv når BTSCs er kultivert under monolayer forhold på laminin-belagt plater, vi har observert at BTSCs synes å motstå bevegelse i den åpne plassen og foretrekker å bo i lukke nærhet til andre celler. Videre etablerte disse migrasjon analyser ikke tillater for visualisering og overvåking av enkeltceller i et eksperiment. Overvåking av individuelle celler over tid er verdifull for vurderingen for heterogene celle populasjoner som BTSCs. ekstra ulemper ved de Boyden kammer, bunnen og celle-ekskludering sone analyser for BTSC kulturer er som de krever relativt høyt tall, kan være tidkrevende å definere, og enten raskt equilibrate eller har ikke chemoattractant gradering. Som sådan, er disse analyser ikke ideelt å bruke for sjeldne eller sakte voksende celle populasjoner eller narkotikarelaterte screening. Videre er disse analyser ikke egnet for å måle en invasjon i en tredimensjonal (3D) format, som er spesielt viktig for BTSCs vokst under neurosphere forhold.
Her beskriver vi analyser spesielt modifisert for observasjon og kvantifisering av overføringen for individuelle BTSCs og invasjonen av GBM BTSCs kultivert som neurospheres. Første analysen beskriver en tilpasning av Boyden kammeret analysen bruker live-celle tidsinnstilt bildebehandling og chemotaxis migrasjon plate for å måle chemotactic celle migrasjon13. Live-celle bildebehandling i flere godt format gjør at visualisering og kvantifisering av celle migrasjon under flere behandling forhold. Andre analysen beskrevet her er en spheroid invasjonen analysen13,17, som måler egenskapene invasiv BTSCs kultivert under neurosphere forhold og innebygd i en 3D ekstracellulær matrix under ulike behandling forhold. Samlet er disse analyser mye mer kompatibel enn tidligere beskrevet metoder for å studere vandrende og invasive egenskapene for heterogene BTSC kulturer. De tilbyr også bedre muligheter for etterforskningen av romanen strategier mot både overføring og invasjon, som bidrar betydelig til sykdommen tilbakefall og dødelighet.
Gitt at kreftceller er aktivt proliferating, utgjør dette en potensiell teknisk utfordring for studier av celle migrasjon. BTSCs er belagt uten vekstfaktorer, som begrenser spredning migrasjon analysen beskrevet her, og chemoattractant graderingen av chemotaxis platen fullt equilibrate ikke over 72 timer. I tillegg som cellene blir overvåket med live-celle imaging over tid, kan celler visuelt overvåkes for å sikre omfattende celledeling ikke skjer. For suksessen til overføring analysen er det viktig å distansere neurospheres helt til enkeltceller og å telle celle tall før plating. Kontaktflate kuler eller plating for mange celler, som resulterer i klumper, kan hindre cellene migrerer gjennom små porene (figur 4A og 4B). Det er også viktig å unngå å skape bobler når plating cellene i chemotaxis migrasjon platen eller plassere membran innsatsen på bunnen reservoaret. Bobler kan endre flyet av fokus og hindre nøyaktig kvantifisering (figur 4C). Hele platen må være belagt med et tynt lag av kollagen fordi dette gir cellene en overflate å navigere på porene på plate, som denne analysen krever cellene overholder og deretter overføre over en biologisk relevante overflate mot chemoattractant.
BTSC overføring protokollen beskrevet her gir kinetic vurdering av enkeltcelle overføring krever færre celler for å teste ulike behandling forhold sammenlignet med eksisterende protokoller. Dette er viktig for kulturer som vokser svært sakte, så det kan være vanskelig å samle et stort antall celler for eksperimentering. Lav pore tettheten av chemotaxis migrasjon platen gir en tregere balanse av chemoattractant gradient, større enn 72 h, og mer effektivt etterligner biologiske prosessen med chemotactic overføring over en lengre periode. Protokollen var optimalisert for å ha et meget tynt lag av kollagen belegg på chemotaxis migrasjon plate å sikre at analysen tiltak migrasjon og ikke invasjon. Den letter også bildebehandling og kvantifisering av enkeltceller som de overholder kollagen matrix belegg membran innsatsen. Imidlertid en begrensning av teknikken er at kvantifisering av overføringen over flere brønner over tid er sterkt forenklet og rask bruk av kommersiell programvare (se Tabell for materiale). En betydelig fordel av migrasjon analysen er som beskrevet her bredt tilpasningsevne protokollen til andre celletyper. Det vil være spesielt nyttig for kvantifisere chemotactic migrering av cellelinjer som enten langsom voksende, vanskelig å følge, eller overføre sakte.
For å sikre suksess for BTSC invasjon analysen, er det nødvendig å samle neurospheres før de blir større enn 200 µm. større kuler har en flyet av fokus som er for stor til å konsekvent bilde og kvantifisere (figur 5C). Videre kan neurospheres begynne å klumpen og samlet med andre neurospheres. Dette påvirker anskaffelsen av nøyaktig og konsekvent data. I tillegg er det viktig at neurospheres tillates å bosette seg på bunnen av brønnen kollagen er fortsatt på is, å tillate neurospheres å avbildes i en enkelt flyet av fokus (figur 5 d). På samme måte er det viktig at kollagen fullt installere uten å flytte platen som dette kan forstyrre dannelsen av en selv matrix, som kan negativt påvirke bildekvaliteten (figur 5 d). BTSC invasjon analysen beskrevet her, er en av de store fordelene at BTSCs kultivert som neurospheres kan vurderes for invasjon direkte, uten å bli dyrket adherently. Videre kan BTSC neurospheres være innebygd i noen ekstracellulær matrix, enten ved hjelp av individuelle komponenter av den ekstracellulære matrisen fra en bestemt vev eller en kommersielt tilgjengelig kjelleren membran blanding. Angi den ekstracellulære matrisen kan bidra til å identifisere eller teste spesifikke mekanismene for invasjon. For eksempel med denne protokollen er det mulig å vurdere effekten av målretting enkeltmedlemmer i matrise metallopeptidase familien av gener som er kjent for å svekke bestemt matrix komponenter. Selv om denne protokollen gjelder BTSC neurospheres, kan eventuelt celler dyrket som kuler brukes på en lignende måte. Eksempler inkluderer brystkreft celler kultivert som mammospheres eller primære tykktarmskreft celler kulturperler som tumorspheres; men begrenser dette teknikken til celletyper som kan vokse som kuler i en kultur. Andre fordeler av både overføring og invasjonen analyser er at de er enkle å definere, de arbeider i 96-brønnen format og dataene er kvantifiserbare over tid.
Samlet for å hindre etter behandling GBM regelmessig, er det viktig å utvikle metoder som lette etterforskningen av BTSC migrasjon og invasjon. Overføring protokollen beskrevet her gir mange fordeler over tidligere etablert migrasjon analyser, særlig for studier av GBM BTSCs. Denne forbedrede overføring protokollen innebærer dissociating BTSCs kultivert under neurosphere forhold og plating enkeltceller i en 96-brønns kollagen-belagt chemotaxis migrasjon plate. Med en live-celle tenkelig system, kan migrering av BTSCs overvåkes og kvantifisert over tid. Invasjonen analysen beskrevet her kan for overvåking av BTSC invasjoner fra neurospheres i en matrise. Denne analysen omfatter innebygging neurospheres i en kollagen matrise eller en annen proteinrik ekstracellulær matrix, i en 96-brønns plate. Avbildning av platen med en live-celle time-lapse tenkelig system tillater analyse av BTSC invasjoner vilkår forskjellig behandling over tid. Disse analyser, gir dermed et verdifullt verktøy for forskere håper å forstå mekanismene bak BTSC migrasjon og invasjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Rozina Hassam og Orsolya Cseh deres kundestøtte. Dette ble støttet delvis av tilskudd fra Canada grunnlaget for innovasjon (å H. Artee Luchman og Samuel Weiss) og Stem Cell nettverk i Canada (også til H. Artee Luchman og Samuel Weiss).
Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |