Här beskriver vi en i situ hybridisering analys som gör det möjligt för känsligt och specifikt påvisande av sekvenser så kort som 50 nukleotider med single-nucleotide upplösning på enskild cell nivå. Analysen, som kan utföras manuellt eller automatiskt, kan aktivera visualisering av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer inom ramen för vävnad.
Eftersom precision medicin är starkt beroende av korrekt påvisande av biomarkörer, finns det ett ökande behov av standardiserade och robust teknik som mäter RNA biomarkörer i situ i kliniska prover. Medan grind-och-bind analyser som RNAseq och kvantitativ RT-PCR aktivera mycket känsliga gen uttryck mätningar, de också kräva RNA-extraktion och därmed förhindra värdefulla uttryck analys inom ramen för morfologiska vävnad. I situ hybridisering (ISH) analysen beskrivs här kan upptäcka RNA mål sekvenser så kort som 50 nukleotider med single-nucleotide upplösning och encelliga nivån. Denna analys är ett komplement till tidigare utvecklade kommersiella analysen och möjliggör känsligt och specifikt i situ detektering av skarv varianter, kort mål och punktmutationer i vävnaden. I detta protokoll, var sonder utformade för att rikta unika exon korsningar för två kliniskt viktiga skarv varianter, EGFRvIII och METΔ14. Påvisande av kort mål sekvenser visades av specifik detektion av CDR3 sekvenser av T-cell receptorer α och β i Jurkat T-cell linje. Också visat är nyttan av denna ISH analys för skillnaden av RNA mål sekvenser med single-nucleotide upplösning (punktmutationer) genom visualisering av EGFR L858R och KRAS G12A single-nucleotide variationer i cellinjer som använder automatiserad färgning plattformar. Sammanfattningsvis visar protokollet en specialiserad RNA ISH-analysen som möjliggör upptäckt av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer i situ för manuell och automatiserad stainers.
Hög genomströmning transcriptomic tekniker såsom microarrays och nästa generations RNA-sekvensering (RNAseq) förbättrats exponentiellt upptäckten av RNA biomarkörer med diagnostiska, prognostiska och prediktiva kliniska värde för olika sjukdomar inklusive cancer1,2. För att främja användningen av dessa biomarkörer i precision medicin, det finns en hög behovet av standardiserade och robust teknik som kan mäta RNA biomarkörer inom vävnad ramen för kliniska prover. Medan allmänt etablerad grind-och-bind analyser som RNAseq och kvantitativ RT-PCR aktivera mycket känsliga gen uttryck mätningar, det krävs vävnad homogenisering och RNA isolering innebär förlust av i vivo celltyp specificitet och morfologisk information3. Konventionella i situ RNA upptäckt metoder saknar känslighet och specificitet som krävs för att tillförlitligt mäta sällsynta eller låg-uttryckande RNA biomarkörer inom den vävnad sammanhang4.
En kommersiell i situ -hybridisering (ISH) analys (t.ex., RNAscope analysen) är en teknik som har tacklat dessa utmaningar och också möjliggör en mycket känsliga och specifika visualisering av enda RNA-molekyler som är större än 300 nukleotider inom ramen för morfologiska vävnad. Denna typ av analys använder en unik oligonukleotiden sonden design av cirka 6 – 20 dubbel-Z sonden par kombinerat med en avancerad hybridisering-baserade signal förstärkning5.
Denna studie beskriver en specialiserad RNA ISH analys, BaseScope, kompletterar den tidigare designat kommersiell teknik som kan upptäcka RNA mål sekvenser så kort som 50 nukleotider enda nukleotid upplösning. Denna analys tar intrikata komplexiteten i transkriptom och är tillämplig för korrekt påvisande av exon korsningar, kort mål sekvenser och punktmutationer i vävnad samband (tabell 1) använder så lite som ett dubbel-Z sonden par. Detta betänkande visar komplett assay protokollet och dess användning för detektion av skarv varianter, CDR3 sekvenser för T-cell receptor kloner, och single-nucleotide mutationer i FFPE cell linjer och tumörvävnad.
I betänkandet diskuterades roman ISH assay protokollet och dess tillämpningar i detalj. Analysen möjliggör direkt visualisering av exon korsningar, kort-mål och mycket homologa sekvenser och punktmutationer i samband med vävnad. Analysen bygger på RNAscope teknik5 och kan således enda molekyl upptäckt. Dock på grund av en avancerad förstärkarsystem, kan signalen upptäckas med sonder som innehåller så lite som ett dubbel-Z par eller med en target mall längd på bara 50 nukleotider. Eftersom sonderna kan vara så kort som en enda dubbel-Z i längd, möjliggör detta upptäckt av exon korsningar, kort-mål och mycket homologa sekvenser och punktmutationer (tabell 1).
För framgångsrika resultat av analysen finns det flera tekniska rekommendationer. Först, vävnader bör fastställas i färsk 10% neutral buffrad formalin (NBF) vid rumstemperatur för 16 – 32 h10. Underfixation ( 32 h) kommer att försämra resultatet av analysen och kan kräva ytterligare optimering. För det andra, för att säkerställa optimal kontroll av temperatur och fuktighet, som krävs för robust sonden hybridisering och signal förstärkning, bilden bearbetning system och hybridisering ugn bör användas för protokollet steg 2,3 till 5 (proteas förbehandling, sond hybridisering, signal förstärkning och signaldetektion). Tredje, överskott kvarvarande buffertar bör vara ordentligt dekanteras före varje steg i hela protokollet (men inte så mycket att vävnadssnitt torka ut). Om glasen torka ut, utvecklar betydande icke-specifik signal. Fjärde, beroende på vävnadstyp av, förbehandling optimering kan vara nödvändigt. Använder den fel proteashämmaren eller utför för en suboptimal tidsperiod kan resultera i under – eller över – digestion och kommer att negativt påverka signalen. Avslutningsvis är det viktigt att alltid köra positiva och negativa kontroller med test sonderna. Negativ kontroll sonder säkerställa att ingen bakgrund signal och positiv kontroll sonder säkerställa att analysen har gjorts korrekt och att RNA kvaliteten i provet är optimal för att tolka testresultat sonden. Om det finns ingen signal med positiv kontroll sonden, sedan RNA i provet är sannolikt suboptimala och en signal kan inte ses med test sonden.
Förutom manuell analysen var förmågan att utföra analysen på automatiserade stainers också påvisas (figur 6). Denna automatiserade ISH-analys ger en hög signal-brus-förhållande och är tillämpliga för samma program som visas i tabell 1. men fördelarna med en automatiserad analys inkluderar standardisering av assay villkor, minimering av Inter användaren variabilitet och hands-on tid, och ersättning för high-throughput screening av vävnadsprover på ett tillförlitligt sätt.
Immunhistokemi (IHC) och qRT-PCR tillåta för detektion av skarv varianter (särskilt EGFRvIII), i FFPE kliniska prover, dessa tekniker kan saknar nödvändiga specificitet och erbjuder inte insikt i den rumsliga upplösningen i skarven variant-uttryck, respektive11,12. En viktig fördel för analysen i detta protokoll är dess mycket känsliga och specifika visualisering av skarv korsningar samtidigt bevara morfologiska vävnad ramen. Här var analysens förmåga att just rikta unika exon korsningar för flera skarv varianter, inklusive EGFRvIII och METΔ14, påvisas (figur 3 och 6). Analysen har dessutom visat att upptäcka splice varianten AR-V7 i prostatacancer, flera isoformer av ErbB4 i hjärnan, och bekräftelse av knockout av cirkulär RNA Cdr1as mus hjärnan3,13,14.
Kort måldetektering sekvens av denna ISH analys möjliggör visualisering av RNA sekvenser så kort som 50 nukleotider i längd, vilket framgår av detektion av CDR3 sekvenser härrör från Jurkat celler (figur 3). Analysen kan också upptäcka gensekvenser som är mycket homologa till andra familjemedlemmar eller arter som framgår av Revêchon et al., som används kort mål analysen för att upptäcka mänsklig progerin uttryckt i mus subkutan vit fettvävnad15. Dessutom kan små nukleolära RNA (snoRNA), CRISPR-medierad gen redigering och föregångare-mikroRNA vara upptäckta i situ med kort mål-analys. Mer nyligen, Fu et al. kombinerat denna ISH analys med IHC att identifiera exakt celler i näthinnan uttrycker de pre-miRNA mir125b16.
Mutation profilering i tumörer är kritisk för att studera utvecklingen av tumörer och för att utveckla riktade terapier. Medan mutation profilering kan uppnås via hög genomströmning sekvensering, kan inte denna teknik fullt ut hantera intratumoral heterogenitet eller länk genetiska förändringar med cellulära morfologi17,18. Påvisande av punktmutationer som använder denna ISH analys möjliggör distinktion av RNA mål sekvenser på singel-base resolution, som validerats av detektion av EGFR L858R och KRAS G12A enda nukleotid variationer i cellinjer (figur 5). Dessutom används Baker et al. punktmutation analysen för att rikta flera mutationer i de BRAF, KRAS och PIK3CA onkogener i kolorektal cancer18. De kunde identifiera och rumsligt karta sällsynt muterade subkloner tumörceller, slutligen visar hur de bidrar till intra-tumör heterogenitet.
Sammanfattningsvis, har en specialiserad RNA ISH-analysen utvecklats. Denna metod möjliggör upptäckt av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer i situ. Det är känsliga, specifika, mätbara och anpassningsbar prestanda både genom manuella metoder och på automatiserade stainers.
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |