Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi
Summary
Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.
Abstract
Hassas tıp biyolojik doğru tespiti son derece bağımlı olduğundan, RNA biyolojik in situ klinik örneklerin ölçmek standart ve sağlam teknolojileri için artan bir ihtiyaç vardır. Kantitatif RT-PCR etkinleştirmek son derece hassas gen ifade ölçümleri ve eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq gibi iken, onlar da RNA ayıklama gerektirir ve böylece değerli ifade analizi morfolojik doku çerçevede önlemek. Burada açıklanan in situ hibridizasyon (ISH) tahlil RNA hedef sıraları gibi 50 nukleotid tek nükleotid çözünürlük ve tek hücre düzeyinde kısa algılayabilir. Bu tahlil daha önce gelişmiş ticari tahlil için tamamlayıcı ve hassas ve belirli in situ tespiti splice türevleri, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar doku içinde sağlar. Bu protokol için probları iki klinik olarak önemli ek yeri değişik, EGFRvIII ve METΔ14 için benzersiz exon kavşak hedeflemek için dizayn edilmiştir. Kısa hedef sıralarının algılama CDR3 dizileri T-hücre reseptör α ve β Jurkat T-hücre doğrultusunda özel algılama tarafından sunuldu. Ayrıca gösterilen bu ISH tahlil için aralarındaki tek nükleotid çözünürlükte (nokta mutasyonlar) aracılığıyla otomatik boyama kullanarak hücre satırları EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler görselleştirme RNA hedef sıralarının yardımcı programıdır platformlar. Özetle, protokol splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situ el ile performans ve otomatik stainers tespiti sağlar özel bir RNA ISH tahlil gösterir.
Introduction
Microarrays ve yeni nesil RNA sıralama (RNAseq) gibi yüksek üretilen iş transcriptomic teknolojileri katlanarak RNA biyolojik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için klinik değerle tanı, prognostik ve akıllı keşfi düzeldi kanser1,2. Bu biyolojik hassas tıpta kullanımı ilerlemek için bir yüksek olan RNA biyolojik doku içeriği klinik örneklerin içinde-ebilmek ölçü standart ve sağlam teknolojileri ihtiyacını. Yaygın olarak eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq ve kantitatif RT-PCR gibi son derece hassas gen ifade ölçümleri etkinleştirmek kurulmuş olsa da, gerekli doku homojenizasyon ve RNA izolasyon içinde vivo hücre tipi özgüllük kaybı anlamına ve morfolojik bilgileri3. Geleneksel in situ RNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük nadir veya düşük ifade RNA biyolojik doku bağlam4içinde güvenilir bir şekilde ölçmek için gerekli yoksun.
Bir ticari in situ hibridizasyon (ISH) tahlil (Örn., RNAscope tahlil) Bunlar ele vardır bir teknoloji meydan okuyor ve ayrıca tek RNA molekülleri 300’den büyük ve son derece hassas ve belirli görselleştirme sağlar nükleotit doku morfolojik içeriği içinde. Bu tür bir tahlil yaklaşık 6 – 20 çift-Z sonda çiftleri bir Gelişmiş hibridizasyon tabanlı sinyal güçlendirme5ile kombine bir benzersiz oligonükleotid sonda tasarım kullanır.
Bu çalışmada BaseScope, RNA hedef sıraları gibi tek nükleotid çözünürlükte 50 nukleotid kısa algılayabilir önceden tasarlanmış ticari teknoloji için tamamlayıcı bir özel RNA ISH tahlil açıklar. Bu tahlil transcriptome karmaşık karmaşıklığı giderir ve exon kavşaklar, kısa hedef dizileri ve nokta mutasyonlar bir çift-Z sonda çiftini kullanarak doku bağlamda (Tablo 1) doğru tespiti için geçerlidir. FFPE tek nükleotid mutasyonların hücre satırları ve tümör doku ve tam tahlil Protokolü ve kullanımı splice türevleri, T-hücre reseptör klonlar, CDR3 dizileri tespiti ile bu rapor gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, roman ISH tahlil Protokolü ve uygulamaları ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Tahlil exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve doku bağlamda nokta mutasyonlar doğrudan görselleştirme sağlar. Tahlil RNAscope teknoloji5 üzerinde temel alır ve bu nedenle tek molekül algılama yeteneğine sahiptir. Ancak, bir Gelişmiş amplifikasyon sistemi nedeniyle sinyal bir çift-Z çifti içeren probları ile ya da sadece 50 nukleotid hedef şablon uzunluğu ile tespit edilebilir. Sondalar gibi tek bir çift-Z uzunluğu kısa olduğu için bu exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve nokta mutasyonlar (Tablo 1) tespiti için sağlar.
Testin başarılı performans için çeşitli teknik öneriler vardır. İlk olarak, dokuların taze % 10 tarafsız tamponlanmış formalin içinde (NBF) 16-32 h10için oda sıcaklığında sabit olmalıdır. Underfixation ( 32 h) tahlil performansını bozabilir ve ek optimizasyon gerektirebilir. İkinci olarak, sıcaklık ve nem, sağlam sonda hibridizasyon ve sinyal güçlendirme için gerekli olan en iyi kontrolünü sağlamak için sistem ve hibridizasyon fırın işleme slayt Protokolü adımları 2.3-5 (proteaz tedavi öncesi, soruşturma için kullanılmalıdır hibridizasyon, sinyal güçlendirme ve sinyali algılama). Üçüncü olarak, aşırı kalan arabellekleri düzgün çıkarmak her adım protokol boyunca önce (ama değil o kadar doku bölümleri kurumasına) olmalıdır. Slaytları kurumasına Eğer önemli non-spesifik sinyal gelişecektir. Dördüncü olarak, doku türüne bağlı olarak, tedavi öncesi optimizasyon gerekli olabilir. Yanlış proteaz kullanarak veya bir suboptimal uzun süre performans altında – veya aşırı – digestion içinde ve sinyal olumsuz etkiler. Son olarak, her zaman pozitif ve negatif kontrolleri ile test probları çalıştırmanız önemlidir. Negatif kontrol probları arka plan çekmiyor ve tahlil doğru yapılması olumlu denetim probları sağlamak ve RNA kalite örnek test sonda sonuçları yorumlama için en uygun olduğundan emin olun. Pozitif kontrol sonda ile sinyal yok RNA kalite örnek sonra suboptimal ve varsa a sinyali test sonda ile görülebilir değil.
El ile testin yanı sıra yetenek otomatik stainers tahlil yapmak da gösterilmiştir (Şekil 6) oldu. Bu otomatik ISH tahlil sinyal / gürültü oranı yüksek verimleri ve Tablo 1‘ de gösterildiği gibi aynı uygulamalar için geçerlidir; Ancak, otomatik bir tahlil faydaları tahlil koşulları, arası Kullanıcı değişkenliği ve uygulamalı zaman pykał standardizasyonu eklemek ve doku örnekleri yüksek üretilen iş tarama için güvenilir bir şekilde ödeneği.
İmmünhistokimya (IHC) ve qRT-PCR splice türevleri (özellikle EGFRvIII), FFPE klinik örneklerin algılanması için izin verirken bu teknikler gerekli özgüllük eksikliği ve splice Uzaysal Çözünürlük içgörü sunuyor musunuz değişken ifadesi, sırasıyla11,12. Bu iletişim kuralı tahlil önemli bir avantajı morfolojik doku bağlam koruma sırasında onun son derece hassas ve belirli görsel olarak splice kavşak var. Burada, tam olarak EGFRvIII ve METΔ14, dahil olmak üzere çeşitli splice türevleri için benzersiz exon kavşak hedeflemek için tahlil’ın yeteneği gösterilmiştir (Şekil 3 ve 6) oldu. Ayrıca, prostat kanseri, beyin ErbB4, birden çok izoformlarının ve dairesel RNA Cdr1as fare beyin3,13,14nakavt onay splice değişken AR-V7 algılamak için tahlil gösterilmiştir.
Kısa hedef sıra tespit bu ISH tahlil tarafından görselleştirme gibi içinde uzunluk, 50 nukleotid kısa RNA dizilerinin CDR3 dizileri (Şekil 3) Jurkat hücrelerden türetilmiş tespiti tarafından gösterildiği gibi sağlar. Tahlil da Revêchon ve arktarafından gösterildiği gibi diğer aile üyeleri ya da türler, son derece homolog gen dizileri algılayabilir., kim kısa hedef tahlil fare beyaz deri altı yağ dokusu15dakika içinde ifade insan progerin algılamak için kullanılır. Buna ek olarak, küçük genelde RNA (snoRNA), CRISPR-aracılı gen düzenleme ve öncü-mikroRNA kısa hedef tahlil ile tespit edilen in situ olabilir. Daha yakın zamanlarda, Fu ve ark. IHC pre-miRNA mir125b16ifade retina kesin hücreleri tanımlamak için bu ISH tahlil birlikte.
Tümörler profil oluşturma mutasyon tümörler ilerleme çalışmak için ve hedefli tedaviler geliştirmek için önemlidir. Mutasyon profil oluşturma yolu ile yüksek-den geçerek sıralama elde edilebilir olsa da, bu teknoloji tamamen intratumoral heterojenlik veya bağlantı genetik değişiklik ile hücresel morfoloji17,18adresi olamaz. Nokta mutasyonlar bu ISH tahlil kullanarak tespiti çözünürlükte bir tek-base, hücre hatları (Şekil 5) EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler tespiti tarafından doğrulanmış RNA hedef sıralarının düzeye çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, Baker ve ark. nokta mutasyon tahlil kolorektal kanser18BRAF, KRAS ve PIK3CA oncogenes birden çok mutasyonların hedeflemek için kullanılır. Onlar tanımlamak ve dağınık şekilde nadir mutant subclones sonuçta nasıl katkıda bulundukları Intra-tümör heterojenite için gösterilen tümör hücrelerinin eşlemek başardık.
Özet olarak, özel bir RNA ISH tahlil geliştirilmiştir. Bu metodoloji splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situtespiti için sağlar. Performans tarafından el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler ve otomatik stainers üzerinde hassas, belirli, ölçülebilir ve adapte olduğunu.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
Referencias
- Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
- Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016)
- An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , (2018).
- Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
- Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
- Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
- Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
- Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , (2017).
- Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , (2017).
- Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
- Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
- Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
- Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).
